2017 Fiscal Year Research-status Report
二重FRETと蛍光寿命画像法を活用した開口放出関連分子の動態解析
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17K08530
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| Research Institution | Kitasato University |
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Principal Investigator |
高橋 倫子 北里大学, 医学部, 教授 (60332178)
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2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 2光子顕微鏡 / 蛍光共鳴エネルギー移動 / 神経シナプス / 内分泌細胞 / PKA / SNARE |
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| Outline of Annual Research Achievements |
膵臓ベータ細胞と神経シナプス前終末において、開口放出関連分子であるSNARE3種の複合化をリアルタイムでモニターするために、二重FRETを起こしうる4つの色素群；①mEGFP, dimVenusおよび②mCyRFP-1, mMaroon でSNARE分子を遺伝子工学的に蛍光標識し、FRETプローブを作製することを目指した。dimVenus よりも更に蛍光発現の少ない ShGFPを①のアクセプターとして選択し、PCR法による組換え技術を用いてpCAG-EGFP-mCyRFP1-Syntaxin1A-C1、pCAG-mCyRFP1-VAMP2-C1、pCAG-ShGFP-SNAP25-C1 3種の発現ベクターを作製した。作製後、本色素群によるFRET法を開発された先生から、①のドナーである mEGFP と、②のドナーであるmCyRFPの間で、FRETを起こすという情報を入手した。1光子励起の場合には、これら①②のドナーを同時に励起し得ないので、二重FRET実験が可能となるが、2光子励起の場合には励起スペクトルが広がるため、①②のドナーを分けて励起できない。したがって、予定した色素組み合わせによるFRET実験は、現有する2光子の実験セットでは実現困難と考察された。そこで、２光子励起顕微鏡で実現可能で、FRET技術を用いる実験として、インスリン分泌に重要な作用を持つ細胞内のPKA活性を調べるために、AKAR2（PKA活性を反映するFRETプローブ）の色素部分をmturquoise(ドナー)とmvenus(アクセプター)に組換えた。そして、インスリン分泌細胞でFRET比を計測する実験系の立ち上げを行った。ウィルスベクターにも搭載し、膵島とインスリン分泌株化細胞に導入し、グルコース刺激における変化の解析を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
9月に東京大学から北里大学に異動しており、実際の実験は東大に残してきた２光子励起顕微鏡を用いて遂行している。大学院入学後１年目にあたる大学院生とは日ごろ蜜に情報を交換し、連絡をとることにより、克服しようとしている。
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| Strategy for Future Research Activity |
大学院生および共同研究先の東京大学医学部構造生理学教室の主宰者と相談した結果、以下の計画を持っている。SNARE蛋白の一つであるSNAP25とSNAP23の複合化について、中途までの実験遂行となり論文発表にいたっていなかった生理実験の続きを行い、論文発表を目指す。具体的には、SNAP25のoligomerization 状態を変えうる変異体のSNAP25蛍光色素プローブをシナプス前終末に導入し、①FRET効率を２光子励起蛍光寿命画像法（FLIM）で計測する、②それぞれの変異体を入れたときの伝達物質放出のキネティクス変化をシナプス後電流（IPSC）計測により評価する、③３年前には計測不可能であった、プレシナプス内のカルシウム濃度測定を、伝達物質放出の検出と同時に行う、④大学内外の研究グループと共同して電子顕微鏡を用いた構造解析を行い、オリゴマーの構造解析行う、⑤近々東京大学に導入される見込みの高い共用機器（超解像顕微鏡）の活用も視野に入れて研究を推進する。
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| Causes of Carryover |
当初は遺伝子組換え実験や培養実験の目的で、物品費（消耗品・動物費）の使用を見込んでいたが、大学勤務先の異動や実験計画の見直しに伴い、一時的に使用額が減じた。今後、当研究課題一部を異動先で遂行できるように、研究用機器（分子生物学実験機器・光学機器）を購入していくことを計画する。
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Research Products
(7 results)
