2017 Fiscal Year Research-status Report
Epithelial splicing regulatory protein 1/2 are involved in cell malignancy and methuosis, a new type of cell death.
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17K08533
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| Research Institution | University of Yamanashi |
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Principal Investigator |
早川 哲 山梨大学, 大学院総合研究部, 助教 (10736200)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | methuosis / 上皮間葉変換 / ESRP |
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| Outline of Annual Research Achievements |
1. SAS細胞を用いたESRP1ノックアウト細胞の解析
SAS細胞に対してCRISPR-Cas9の系によりESRP1のノックアウト細胞を樹立し、Rac1bの発現および運動性を解析したところいずれも親株にたいして顕著な上昇が確認できた。この結果はESRP1のノックダウンにおいてもすでに報告されているが、ESRP1ノックアウト細胞においても再現された。今後は発現ベクターを用いてレスキューの確認、ESRP1とESRP2のキメラを用いて二つの遺伝子の発現による違いを解析する。
2. ESRPsノックアウト・ノックダウン細胞の確立
SAS細胞に対してCRISPR-Cas9の系によりESRP2のノックアウト細胞株の作製を試みたがクローン単離後に細胞が増殖を停止し、細胞株が得られなかった。ESRP1についてはノックアウト細胞が確立できたのに対し、ESRP2では取得できない原因の解析を検討中である。
MCF10AT細胞はTETオンシステムを利用したESRPのshRNA誘導系の細胞株の樹立を試みた。まずMCF10AT細胞にTET repressorを恒常的に発現する細胞株を作製した（MCF10AT TRと命名）。並行してレンチウイルスによる感染で細胞株の取得を試みるため複数のESRP1に対するshRNAを導入したエントリーベクターを作製し、293FT細胞を用いてESRP1のノックダウンの効果を検討したところ、３種のベクターで効率よいESRP1発現のノックダウン効果が認められた。このエントリーベクターからレンチウイルス導入用ベクターを作製した。MCF10AT TR細胞に作製したレンチウイルスによる感染を試みたが、感染効率が極めて低かったのでレンチウイルス導入用ベクターを直接MCF10AT TR細胞にトランスフェクションし、Zeocin耐性による細胞株を取得中である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
MCF10ATノックアウト細胞の作製ができず、誘導系のノックダウン細胞株の作製に移行した際、誘導系細胞株の樹立に時間が掛かってしまった。
体調不良により２０１７年６月下旬から翌年１月末まで病欠休暇および休職し、２月より仕事に復帰し、研究を再開。
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| Strategy for Future Research Activity |
ESRP1ノックアウトSAS細胞ではESRP1の再導入によるレスキュー実験を解析する。さらにESRP1とESRP2のキメラ変異体を導入することでESRP1とESRP2の機能の相違について解析する。ESRP2のノックアウトSAS細胞は樹立に至っていないが原因解明と並行して樹立が困難と判断した場合も想定し、MCF10AT細胞と同様に誘導系のノックダウン細胞株の樹立も検討する。
MCF10AT細胞による実験ではESRP1/2ノックダウン誘導系細胞株の樹立後、多角的に解析を遂行する。テトラサイクリン存在下で標的タンパクの発現低下を確認し、現時点までに得られたsiRNAによるノックダウンの結果と比較し同様の影響が再現できるかどうかを解析する。さらに長期的にノックダウンを行い、ノックアウト細胞樹立時に観察されたmethuosisが起きるか解析する。Methuosisが確認できた場合、そのメカニズムについてタンパクレベルではrasおよびrac1の活性化の解析、mRNAレベルではrac1bを始めとしたmRNAのスプライシング変化等を解析し、細胞レベルでは種々の細胞分子マーカーを用いてmacropinocytosisの変化を解析し、methuosisの原因についての知見を得ることを目標とする。
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| Causes of Carryover |
理由：体調不良による病欠および休職により想定量の実験が遂行できなかったため。
使用計画：前年度で遂行できなかった実験に必要な試薬等の購入に充てる。
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