2018 Fiscal Year Research-status Report
Elucidation of mechanisms of myocardial ischemia/reperfusion injury mediated through transient receptor potential canonical (TRPC) channels, and establishment of new therapeutics for its treatment.
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17K08536
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| Research Institution | Shiga University of Medical Science |
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Principal Investigator |
松浦 博 滋賀医科大学, 医学部, 教授 (60238962)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
小嶋 亜希子 滋賀医科大学, 医学部, 助教 (50447877)
星野 真介 滋賀医科大学, 医学部, 助教 (70747576)
林 維光 滋賀医科大学, 医学部, 助教 (80242973)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 心筋虚血再灌流傷害 / Ca2+過負荷 / TRPCチャネル / TAC手術 / 肥大心 / 不全心 / Ca2+/カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼ / リアノジン受容体 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究課題では，虚血再灌流障害に関わる細胞内Ca2+過負荷に、細胞膜Ca2+透過型陽イオンチャネルであるTRPC（transient receptor potential canonical）チャネルが関与している可能性を、広く正常心臓から病態心臓（肥大心，不全心）を用いて検討を行うことを目的としている。
1. 成体C57BL/6Jマウス（7～8週令、オス）を実体顕微鏡下に第２肋間より左開胸して、腕頭動脈と左総頸動脈の間の大動脈弓部に7-0絹糸でbandingを行い、大動脈狭窄を作成して左心室に圧負荷をかけるTAC（transverse aortic constriction）手術を行った。さらに同様の操作を行うが、bandingを行わないSham手術も施行した。手術後約2～4週間に、TACマウスとShamマウスの心臓／体重比を計測すると、TACマウスにおいて有意に増加していることが確認できた。
2. TAC手術およびSham手術を行ったマウスの心臓から酵素処理により左心室筋細胞を単離してパッチクランプ法を施行した。まず、左心室筋細胞の細胞膜容量を計測すると、TACマウスにおいてShamマウスと比較して有意に大きいことが確認できた。これらの結果は、TACマウスにおいて左心室筋細胞の増大に起因した心肥大が発生していることを示している。
3. 虚血再灌流傷害のトリガーの一つと考えられている活性酸素種の一つである過酸化水素（H2O2）を作用させると、TAC心室筋細胞で有意に遅延後脱分極（delayed afterdepolarization, DAD）とそれに伴う撃発活動（triggered activity）の発生が増加していた。このことは、TAC左心室筋細胞において、虚血再灌流傷害に対する脆弱性（vulnerability）が亢進していることを示唆している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
以下の実験の進捗により、本研究課題の進捗状況について、おおむね順調に進展していると判断する。
1. TAC（transverse aortic constriction）手術により心肥大・心不全モデルマウスの作成を行うことができたこと。
2. TAC手術およびSham手術を行ったマウスの左心室心筋にウェスタンブロッティングを施行して、Ca2+/カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼII（CaMKII）とリン酸化II型リアノジン受容体の発現を検討することができたこと。
3. 酵素処理により左心室筋細胞を単離してパッチクランプ法を施行して、虚血再灌流傷害のトリガーの一つである過酸化水素（H2O2）を作用を検討することができたこと。その結果、TAC左心室筋細胞において、虚血再灌流傷害の原因である遅延後脱分極（delayed afterdepolarization, DAD）とそれに伴う撃発活動（triggered activity）の発生が増加することが明らかとなり、このことはTAC心臓が虚血再灌流傷害に関わるCa2+過負荷に対する脆弱性（vulnerability）が亢進していることを示唆している。
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| Strategy for Future Research Activity |
Sham手術を施行したマウスから得られたコントロール心臓およびTAC手術によって作成した肥大心臓、不全心臓を用いて以下の実験を行い、肥大心、不全心におけるTRPCチャネルのアイソフォーム発現の変化および虚血再灌流傷害の発生の程度の変化について解析する。
１. コントロール心臓および肥大心臓、不全心臓に酵素（コラゲナーゼ）処理を行い，左心室筋細胞を単離して、Real-time PCR法、ウェスタンブロッティング法、免疫細胞化学法、パッチクランプ法を適用して、TRPCチャネルの機能的発現の変化を解析する。
２．ShamマウスおよびTACマウスから摘出した心臓をランゲンドルフ灌流下に虚血（30分間の灌流停止）および再灌流（60分間）を施行する。左心房から左心室にバルーンカテーテルを挿入して左心室機能（収縮期・拡張期圧）の計測を行い，さらに心電図記録により不整脈の発生も解析して，再灌流時の心機能の回復の程度から、肥大心および不全心における虚血再灌流傷害の程度を正常心と比較する。さらに、2-APB（5 μM)、La3+（10 μM）、Pyr3(0.5 μM)、YM-58483（0.5 μM）の作用から、肥大心、不全心におけるTRPCチャネルの虚血再灌流傷害における関与を検討する。
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| Causes of Carryover |
次年度使用額として、1,389円が生じたが、次年度に薬品などの物品費として使用予定である。
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[Journal Article] Novel intracellular transport-refractory mutations in KCNH2 identified in patients with symptomatic long QT syndrome.2018
Author(s)
Fukumoto D, Ding WG, Wada Y, Fujii Y, Ichikawa M, Takayama K, Fukuyama M, Kato K, Itoh H, Makiyama T, Omatsu-Kanbe M, Matsuura H, Horie M, Ohno S
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Journal Title
J Cardiol
Volume: 71
Pages: 401-408
DOI
Peer Reviewed
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