2017 Fiscal Year Research-status Report
心筋選別とiPSテクノロジーによる先天性QT延長症候群タイプ６の病態・病因解明
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17K08539
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| Research Institution | Tottori University |
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Principal Investigator |
白吉 安昭 鳥取大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (90249946)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
李 佩俐 鳥取大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (40464292)
池田 信人 鳥取大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (50620316)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 先天性QT延長症候群 / 疾患iPS細胞 / ペースメーカ細胞 / 心室筋細胞 / MiRP1 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、先QT延長と徐脈という異なる二つの症状を呈する天性QT延長症候群タイプ6（LQTS6）の病態・病因解明を目的とする。そのために、患者由来疾患iPS細胞から洞結節ペースメーカ細胞と心室筋細胞の2種類のサブタイプ心筋を作製し、それぞれのサブタイプ心筋の生理学的特性等を明らかにする。これらサブタイプ心筋の調整は、我々が開発したペースメーカ細胞および心室筋細胞の選択的可視化法によって行う。本年度は、疾患iPS細胞の遺伝子改変によるペースメーカ細胞および心室筋細胞の可視化を試みた。
まず、米国コロンビア大よりLQTS6の疾患iPS細胞を入手し、心筋分化誘導法によって拍動する心筋を分化誘導できること、報告通りMiRP1遺伝子にM54T変異があることを確認した。続いて、可視化のための遺伝子改変を行った。具体的には、CRIPR/Cas9システムによるゲノム編集法によって、MLC2v遺伝子座にmCherry赤色蛍光タンパク質遺伝子のノックインを試みた。MLC2v遺伝子のエクソン1の一部をmCherryによって置き換えた＃M2株の樹立に成功した。この株を心筋へ分化誘導すると、誘導後3～4週間に拍動する領域でのみmCherryが発現することが分かった。これは、これまでに我々が樹立したMLC2v―mCherryノックイン株とほぼ同等の発現パターンであることから、MLC2vの発現のｍCherryによる可視化に成功しているのではないかと考えている。現在、セルソーターによって陽性細胞を分取し、MLC2vの発現等を検証中である。続いて、HCN4-ECFP-BACを用いて、HCN4遺伝子座にEGFPをセミノックインした細胞株の樹立を試みたが、、現時点では、改変iPS細胞株の樹立には至っていない。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
ヒトLQT6-iPS細胞株を用いたMLC2v遺伝子座へのmCherryのノックインは、CRIPR/Cas9システム法によって想定通り進行し、細胞株（＃M2）を樹立することができた。しかし、HCN4-ECFP-BACベクターの＃M2株への導入には成功しておらず、本年度の目標であった細胞株の樹立には至っていない。エレクトロポーレーション法で複数回に渡って試みたが、導入後、生存するコロニーがほとんど得られないのが原因である。
エレクトロポレーションによる細胞死が原因と考えられることから、エレクトロポーレーション法からリポフェクション法に遺伝子導入方法を変更し、BACベクターの導入を試みた。直近の導入では、多数のコロニーが形成されていて、それぞれをクローニングし、心筋へ分化誘導後、拍動部位でEGFPを発現するコロニーのスクリーニングを進めている。また、同時並行して、HCN4-ECFP-BACベクターの代わりに、CRIPR/Cas9法を用いたゲノム編集法によるHCN4遺伝座へのEGFPの挿入も、新たな試みとして開始している。
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| Strategy for Future Research Activity |
引き続き、改変ヒトiPS細胞株の樹立と、樹立した細胞株からのペースメーカ細胞および心室筋細胞の選択的分取を行う。分取したペースメーカ細胞（HCN4陽性）および心室筋細胞（MLC2v陽性）について、その特性解析を行い、LQTS6の病態をヒトLQTS6-iPS細胞を用いたin vitro実験系で再現できるかどうか、徐脈とQT延長が、どちらの細胞に由来するのかを解明を目標とする。
1．各種心筋を可視化できるLQTS6細胞の樹立
LQTS6-iPS細胞を用いて、Mlc2vミオシン軽鎖の発現を指標に心室筋細胞を可視化できるiPS細胞株＃M2株の樹立に成功しているので、続いて、（1）青色蛍光タンパク質（CFP）を組み込んだBAC（Bacterial Artificial Chromosome）ベクターによるセミノックイン法によって、HCN4の発現をECFPで可視化できる2重改変ヒトiPS細胞株の樹立を試みる。（2）この二重改変LQTS6細胞株を樹立できれば、続いて、CRIPR/Cas9システムでM54T変異の修復（Gene Correction）を行い、修復コントロール細胞株（C-iPS細胞）を作製する。
2．ペースメーカ/心室筋細胞の選別採取と病態解析
LQTS6-iPS細胞から心筋を分化誘導し、セルソーターを用いてヒトHCN4陽性細胞（CFP陽性）やMLC2v陽性細胞（mCherry陽性）を選別採取する。目的のペースメーカ・心室筋細胞が分取できているかを確かめるために、①リアルタイムPCRや免疫染色によるマーカー遺伝子の発現解析、②パッチクラプ法による電気生理学的解析（活動電位、自動能、If電流やIk1電流の有無、Ikr/Iks電流の検出を行い、それぞれの細胞が目的の細胞であるか、特有の病態を示すかどうかを調べる。
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| Causes of Carryover |
ヒトiPS細胞の遺伝子改変を2種類計画していたが、その一方の改変が予定通り進行せず、細胞培養費用等に余剰が出た。次年度は、予定通り進行しなかった遺伝子改変をさらに進める。
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