2017 Fiscal Year Research-status Report
呼吸リズム形成に関わる延髄アストロサイトの周期性自発活動機構の解明
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17K08559
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| Research Institution | National Hospital Organization Murayama Medical Center |
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Principal Investigator |
岡田 泰昌 独立行政法人国立病院機構村山医療センター(臨床研究部), 電気生理学研究室, 室長 (80160688)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 呼吸調節 / 呼吸リズム形成 / 延髄 / 摘出脳幹脊髄標本 / カルシウムイメージング / グリア細胞 / アストロサイト / preBotzinger Complex |
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| Outline of Annual Research Achievements |
自律的な呼吸リズムの形成メカニズムについては、これまでニューロンを対象とした多くの研究がなされてきたが、その実態は未解明であった。研究代表者らは、先行研究での延髄スライス標本を用いた実験により、吸息性ニューロンに先行して呼吸活動を呈する呼吸性アストロサイトを発見し、延髄アストロサイトが呼吸リズム形成に関与している可能性を示唆した。そこで、本研究では、スライス標本に比し広範囲の脳幹部ネットワーク機構が温存されている標本の呼吸リズム形成機構におけるアストロサイトの役割を解明することを目的とした。
実験では、新生ラットより作成した摘出脳幹脊髄標本にカルシウムイメージング法を応用し、細胞活動計測を行った。計測は、頚髄前根より呼吸神経出力をモニターしつつ行った。標本吻側断面で、呼吸リズム形成で重要とされるpreBotzinger Complex（preBotC）領域に蛍光カルシウム指示色素Oregon Greenを注入した。preBotC領域にレーザー光（488 nm）を照射し、そこからの蛍光（507 nm）を、高感度CCDカメラを装着した共焦点スキャナを用いて記録した。実験プロトコールとしては、まず、標準の人工脳脊髄液で標本を灌流しつつ細胞活動の計測を行った後、TTXを加えた人工脳脊髄液での灌流によるシナプス伝達遮断下でも計測を行った。
その結果、延髄preBotC領域において、呼吸リズムと同期した活動を呈するニューロンおよびアストロサイトを見出した。そして、TTX存在下では、ニューロン活動は消失するが、アストロサイトの活動は維持されることが確認され、アストロサイトの活動はニューロン活動に依存しない自律性のものであることが示された。本研究により、摘出脳幹脊髄標本というネットワーク機構が高度に温存された標本においても、延髄アストロサイトは呼吸リズム形成に関与しているものと考察された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
それは、カルシウムイメージング法で計測した細胞を、ニューロンとアストロサイトとに分類するための方法の確立にやや時間を要したためである。ただしこの問題は、文献に基づき、標準の計測後に、標本を低カリウム液で灌流することにより、細胞をニューロンとアストロサイトとに分類するという方法の妥当性を確認しえたので、解決済みである。
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| Strategy for Future Research Activity |
呼吸性アストロサイトの周期性自発活動が、呼吸リズム形成に関わる詳細なメカニズムを明らかにする。そのため、以下の実験を行う。
(1) アストロサイト活動の薬理学的抑制・刺激に伴う吸息性ニューロン活動の変化： アストロサイト活動を抑える薬剤（fluoroacetate, aminoadipic acid, arundic acid, L-methionine sulfoximineなど）、アストロサイトのカルシウムオシレーションを抑えると予想されるIP3受容体阻害剤（2-APBなど）、およびアストロサイト活動を刺激する薬剤（t-ACPD）を投与した際の吸息性ニューロン活動および呼吸神経出力の変化を解析する。これら実験によって、吸息性神経出力形成におけるアストロサイトの機能的役割を明らかにする。
(2) グリオトランスミッターの受容体抑制に伴う吸息性ニューロン活動の変化： 呼吸性アストロサイトからグリオトランスミッターとして周期的に分泌され、吸息性ニューロンを興奮させている可能性のあるグルタミン酸、ATPについて、それらの受容体拮抗薬（CNQX, D-AP5, MK-801, PPADSなど）を投与した際の呼吸神経出力、および吸息性ニューロン活動を、前吸息性アストロサイト活動とあわせて、カルシウムイメージング法により解析する。
(3) 実験結果の総合的評価に基づく呼吸リズム形成理論の確立： 上記の解析結果を総合的に検討し、preBotCにおける呼吸リズム形成機構について、呼吸性アストロサイトの周期的自発活動の発生機序、それが呼吸性ニューロンと同期する機序の解明を、呼吸性アストロサイトから放出されるグリオトランスミッターの同定とともに行なう。これにより、preBotCにおいてグリア細胞が関与した呼吸リズム形成の詳細な機序を解明する。
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| Causes of Carryover |
次年度使用額が生じた理由： 次年度使用額が生じたのは、物品費、旅費、人件費・謝金、その他の各支出額が、研究代表者の工夫により、当初の予算よりも少なくなるよう、抑えられたためである。
次年度使用計画： 次年度には、さらに多くの実験およびその成果発表を行う予定をしているため、次年度使用額は次年度に有効に使用される予定である。
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[Presentation] Activated astrocytes induce persistence of post-stress blood pressure elevation2017
Author(s)
Hasebe Y, Sugama S, Takeda K, Koizumi K, Yokota S, Fukushi I, Hoshiai M, Kakinuma Y, Pokorski M, Horiuchi J, Sugita K, Okada Y
Organizer
International Society for Autonomic Neuroscience Meeting (ISAN 2017)
Int'l Joint Research
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