2017 Fiscal Year Research-status Report
Endocytosis-independent membrane fusion peptides for cancer stem cell drug delivery
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17K08590
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| Research Institution | Mie University |
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Principal Investigator |
島田 康人 三重大学, 医学系研究科, 講師 (40378427)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
市原 佐保子 自治医科大学, 医学部, 教授 (20378326)
小出 裕之 静岡県立大学, 薬学部, 助教 (60729177)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | リポプレックス / エンドサイトーシス / 前立腺がん |
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| Outline of Annual Research Achievements |
癌幹細胞は種々のがん発生の原因であるとともに、その自己複製能・多分化能から遠隔転移・晩期再発の大きな原因の１つと考えられており、これを標的とすることにより持続的な治癒状態の達成が期待されている。しかし癌幹細胞は腫瘍組織内における存在数が少ない上に、エンドサイトーシス・トランスポーターなど細胞内からの薬物排出機構が活性化しているため抗がん剤耐性が非常に高く、有効な治療法が存在していないのが現状である。本研究ではこれまで開発してきたエンドサイトーシスを惹起しない脂質膜融合性コイルドコイル型ペプチドを用いて、癌幹細胞への選択的ドラッグデリバリー技術の構築を目的とした。
本年度は、(1) 抗体結合コイルドコイル型ペプチドの合成、(2) 新規コイルドコイル型ペプチド・リポソームを用いた培養細胞試験、(3) がん細胞移植ゼブラフィッシュを用いた抗がん剤投与試験を行った。当初計画からsiRNAの標的遺伝子（Bcl-xLからCCNB1）、リポソーム調整法（多層性リポソーム：リポプレックス）の変更を行ったが、予想通りの結果が得られている。CD44BPを結合させたK4ペプチドとCPEリポプレックスを用いた薬物送達技術により、癌幹細胞に対してsiRNAおよびドキソルビシンの導入・細胞増殖抑制に細胞培養系・がん移植ゼブラフィッシュの両方にて成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
siRNA標的遺伝子として当初はBcl-xLを予定していたが、報告数の多さからCyclin B1 (CCNB1)を検討した。実際のノックダウン効率・細胞増殖抑制作用を検討したところ、骨転移性前立腺癌細胞PC-3M-Pro4においても有意な効果を認めたため、CCNB1 siRNAの使用を決定した。このsiRNAに近赤外蛍光色素Cy5を結合させたCy5-CCNB1 siRNAを以降の実験に使用した。また、リポプレックスは多層性リポソームであり、特に生体内でのsiRNAデリバリーにおいてsiRNAの分解の抑制が研究分担者により報告されている。実際に10% FBS存在下でHeLa細胞に対するsiRNAデリバリーを検討したところ、リポプレックスを使用した場合のほうが、通常のリポソームより細胞内へのsiRNA導入効率が高いことを確認した。
細胞表面に結合するCD44に結合するペプチドをK4ペプチドに結合させたものを合成し（CD44BP-K4）、PC-3M-Pro4のALDH(high)細胞に投与し、Cy5-CCNB1 siRNAを含むCPEリポプレックスを1時間投与後、洗浄、蛍光顕微鏡を用いて観察し、siRNAの細胞内導入を確認した。3日後、細胞増殖試験を行い、CCNB1 siRNAによる増殖抑制が確認した。同様の試験をドキソルビシン含有CPEリポプレックスでも行った。
次に、ゼブラフィッシュを用いた薬物送達試験を行った。受精後48時間のゼブラフィッシュTg (kdrl:EGFP)系統にPC-3M-Pro4 ALDH(high)200細胞を血管内に移植し、その24時間後にCD44BP-K4とsiRNAあるいはドキソルビシンリポプレックスを投与した。72時間後に体内の癌細胞量を蛍光顕微鏡を用いて観察したところ、CD44-K4とCPEリポプレックスの組合せでは癌幹細胞量が有意に減少していた。
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| Strategy for Future Research Activity |
がん細胞移植マウスを用いた抗がん剤投与試験を行う。
BLAB/c Nude マウスにPC-3M-Pro4 細胞およびそのALDH(high) 癌幹細胞を移植する。移植方法は皮下および血管内とする。この際、生体イメージングを可能にするため、この細胞にはレンチウイルスを用いてルシフェラーゼを発現させる。移植後、癌幹細胞の生着をイメージングで確認した後、ドキソルビシンあるいはCCNB1 siRNA を含有した本リポプレックスを血管内から投与し、癌幹細胞への影響、特に骨転移部に注目した解析を行う。再現性を重視するため同じ試験を２回行う。次年度の病理組織学的解析として、がん組織を回収する。
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