2017 Fiscal Year Research-status Report
アストロサイトPACAP/PAC1Rシグナルが関与する恐怖記憶メカニズムの解明
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17K08599
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| Research Institution | Kagoshima University |
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Principal Investigator |
宮田 篤郎 鹿児島大学, 医歯学域医学系, 教授 (60183969)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
神戸 悠輝 鹿児島大学, 医歯学域医学系, 助教 (60549913)
栗原 崇 鹿児島大学, 医歯学域医学系, 准教授 (60282745)
塩田 清二 星薬科大学, 先端生命科学研究所, 教授 (80102375)
平林 敬浩 星薬科大学, 先端生命科学研究所, 寄附講座等助教 (40297015)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | PACAP / PAC1 / 恐怖記憶 / アストロサイト-ニューロン乳酸シャトル / グリコーゲン / 乳酸 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
これまでの我々の解析から，恐怖記憶を獲得する時に海馬組織特異的なグリコーゲン分解と乳酸増加を惹起することが明らかとなっている．すなわち，アストロサイト-ニューロン乳酸シャトル (ANLS) が機能的に働き恐怖記憶の学習に関与していると推察される．さらに，ANLSはPACAP (-/-) において機能が弱まることから，PACAPはANLSの活性化因子であることが推察され，特にPACAP特異的な受容体として知られるPAC1Rが重要な役割を担っていると考えている．脳内においてグリコーゲンはアストロサイト特異的に存在していることから，本研究において海馬アストロサイト特異的なPAC1Rのノックアウトを達成する必要がある．我々は，まずPAC1Rのゲノム領域であるAdcyap1r1にCrispr/Cas9が認識するPAM配列を見出し，ガイドRNAとAdcyap1r1への相同配列を有するターゲティングDNAを，受精卵へマイクロインジェクションしている．さらに，GFAPプロモータの下流でCreを発現するアデノ随伴ウイルス (AAV) を作成し，アストロサイト特異的なCreの発現を誘導できることを確認済みである．今後，これらの材料を用いて，海馬アストロサイト特異的なPAC1R (-/-) マウスを作成し，恐怖記憶とANLSにおよぼす効果を検証していく．
一方，アストロサイトのANLSの活性化にはPKCが関与する知見を得ている．そこで，我々はGFAPプロモータの下流でデザイナー薬剤により活性化するデザイナー受容体(DREADD) を発現するAAVを作成し，海馬のアストロサイトに感染後，クロザピンNオキシドを腹腔内投与すると，cFos陽性の海馬アストロサイトが顕著に増加することを見出している．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
昨年度はアデノ随伴ウイルスによる実験系と，デザイナー薬剤により活性化するデザイナー受容体 (DREADD) の実験系を立ち上げ，海馬アストロサイト特異的なDREADD遺伝子 (hM3DおよびhM4D) 発現を達成し，海馬アストロサイト特異的にPKCを活性化させることに成功させた．さらに，PAC1Rのfloxマウスの作成に関しては，すでに受精卵へのマイクロインジェクションが進行しているとともに，米国においてPAC1Rのfloxマウスが作成されたという情報を受け，現在鹿児島大学への譲渡を交渉中であり，いずれかの方法によって近日中にPAC1Rのfloxマウスが使用可能になる可能性が高い．以上の様な理由から，(2) の概ね順調に進展しているとした．
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| Strategy for Future Research Activity |
本年度は引き続きPAC1Rのfloxマウスを作成すると共に，確立された海馬アストロサイト特異的なデザイナー薬剤により活性化するデザイナー受容体の実験系を用いて，海馬アストロサイト選択的にPKCを活性化し，恐怖記憶およびANLSの活性化の指標として，in vivoマイクロダイアリシス法を用いて細胞外乳酸濃度を測定する予定である．
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| Causes of Carryover |
当初購入予定であった機器を使用する実験計画に変更が生じたため
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[Journal Article] In Silico Screening Identified Novel Small-molecule Antagonists of PAC1 Receptor2018
Author(s)
Takasaki I, Watanabe A, Yokai M, Watanabe Y, Hayakawa D, Nagashima R, Fukuchi M, Okada T, Toyooka N, Miyata A, Gouda H, Kurihara T.
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Journal Title
J Pharmacol Exp Ther.
Volume: 365(1)
Pages: 1-8
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Dysfunctional GPR40/FFAR1 signaling exacerbates pain behavior in mice2017
Author(s)
Nakamoto K, Aizawa F, Miyagi K, Yamashita T, Mankura M, Koyama Y, Kasuya F, Hirasawa A, Kurihara T, Miyata A, Tokuyama S
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Journal Title
PLoS One
Volume: 12(7)
Pages: e0180610
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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