Regulation of glutathione production by sulfuration induced by polysulfide/hydrogen sulfide

2017 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17K08613
• Research Institution: National Center of Neurology and Psychiatry
• Principal Investigator: 木村 由佳 国立研究開発法人国立精神・神経医療研究センター, 神経研究所, 科研費研究員 (60425692)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: ポリサルファイド / 硫化水素 / グルタチオン / システイン / 酸化ストレス / 過硫化

Outline of Annual Research Achievements

我々はH2Sが過硫化した、即ちイオウが直鎖状に複数結合したポリサルファイド(H2Sn、n≧2)が脳細胞に存在し、酵素により産生する内在性シグナルであることを報告してきた。これらH2SnはアストロサイトではH2Sの300倍の強さでCa2+応答を誘発する(Kimura et al, 2013等)。
本年度はシステイン(Cys)やグルタチオン(GSH)が過硫化したシステインパーサルファイド(Cys-SSH)やGSSHに注目した。これらはレドックス調節分子であると考えられ、強い還元力を持つことが報告されているがその合成酵素は良くわかっていなかった。
我々は、Cys-SSHとGSSHが3-メルカプトピルビン酸イオウ転移酵素(3MST)により、H2S2やH2S3とともに産生されることを見出した(Kimura Y et al, Sci, Reports, 7: 10459, 2017)。即ち、野生型マウス脳で産生されるCys-SSHとGSSHが、3MST-KOマウスで産生されない、精製リコンビナント3MSTおよび3MST発現させたCOS細胞ライセートでは、Cys-SSHとGSSHが生理的濃度のCysとGSH存在下で産生され、より低濃度のCysとGSH存在下では、よりイオウ鎖が長いCys-SSnHとGSSnH (n≧2)が産生されること等を見出した。
我々はH2Sが神経細胞を酸化ストレスから保護することを報告している(Kimura Y & Kimura H, FASEB J 2004)。本年度の研究から、H2Snにも神経細胞をグルタミン酸誘発性酸化ストレスから保護する作用があることを見出した。この時細胞内のCysおよびGSHが上昇しており、GSHの上昇により細胞保護作用が現れることが分った。またH2Sを培地添加後に酸化して生じるSO3(2-)にも細胞保護作用があることを見出した(投稿中)。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本年度はH2SnがH2Sと同様に細胞内GSHレベルを上昇させて、神経細胞を酸化的ストレスから保護すること、H2Sが酸化してできるSO3(2-)にも細胞保護作用があることを見出し、論文に投稿中である。
Cys、GSHが過硫化した分子であるCys-SSHとGSSHは強い還元力を持ち、レドックス調節分子として認識されている。本年度は今までよく分っていなかったCys-SSHとGSSHの合成酵素が3MSTであり、H2S2やH2S3とともに産生されること、生理的濃度のCys、GSH存在下では主としてCys-SSHとGSSHが産生され、より酸化状態、即ちCysやGSH濃度が低い条件では、イオウがさらに結合したCys-SSnHとGSSnH(n≧2)が優先的に産生されることを報告した(Kimura Y et al, Sci. Rep. 2017)。
研究成果は論文7件にまとめ、国際学会ConBio2017において学会発表3件を行った。
このように全体としておおむね順調に研究が進展している。

Strategy for Future Research Activity

昨年度より進めていたTRPA1遺伝子改変ラットからのホモラット(TRPA1-KO)系統の確立が完了し、ホモラットが安定して得られるようになった。H2SnはアストロサイトでTRPA1チャネルを活性化させて細胞内Ca2+ 濃度を上昇させるので、TRPA1-KOラットではこの作用が消失するかを検討する。
現在3MST遺伝子改変ラットからのホモラット(3MST-KO)系統の確立を行っている。5匹のファウンダーからヘテロラットの作製が完了しており、これらを交配させて3MST-KOの作出中である。我々は既に3MSTがH2S、H2Sn、Cys-SSH、GSSHなどの過硫化分子の産生を担うことを報告してきた。3MST-KOラットの確立後は、これら分子の産生、生物作用などへの3MSTの関与を明確にしていきたい。また3MST-KOラットとTRPA1-KOラットを交配してダブルKOラットを産生し、H2Snなどの生物作用におけるこれら遺伝子の役割を検討していきたい

Causes of Carryover

H2S、H2Sn、Cys-SSH、GSSHなどの産生を担う酵素である3MSTの作用確認のため、3MST-KOラットの確立を行っている。　3MSTヘテロ接合体(+/-)の引き渡しが1年以上遅れ、それに伴い3MST-KOラット系統の確立も遅れた。
また、研究室の移動に伴う、引っ越しの準備、実施、新しい場所での実験環境整備などのため実験のできない期間があった。実験開始後も、移動した機器の故障、修理により使用できない期間があり実験ができない期間がさらに長引いた。これらの理由により次年度使用額が生じた。
現在3MSTヘテロ接合体(+/-)ファウンダーラットの飼育、繁殖により、3MSTヘテロ接合体(+/-)と3MST-KOラットの作出を行っている。そのためラットの飼育費用、繁殖に必要な野生型ラットの購入費が必要である。ラットの遺伝子型決定のために、PCR用消耗品、酵素、シーケンス(外注)費用が必要である。3MST-KOラット系統確立後は、昨年度までに確立したTRPA1-KOラットとの交配を行い、3MSTとTRPA1ダブルKOラット系統を確立する予定である。得られたKOラットはCa2+イメージングなどの生化学実験、行動実験などに使用予定である。Ca2+イメージングには細胞培養用消耗品(ポリ-D-リジンコートディッシュ、培地、血清など)やCa2+感受性蛍光試薬であるカルシウムグリーン1等が必要である。

Research Products

• [Journal Article] Alternative pathway of H2S and polysulfides production from sulfurated catalytic-cysteine of reaction intermediates of 3-mercaptopyruvate sulfurtransferase. (2018)
  • Author(s): Nagahara, N., Koike, S., Nirasawa, T., Kimura, H., Ogasawara, Y.
  • Journal Title: Biochem. Biophys. Res. Commun. Volume: 496 Pages: 648-653
  • DOI: org/10.1016/j.bbrc.2018.01.056.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Discovery and mechanistic characterization of selective inhibitors of H2S-producing enzyme:: 3-mercaptopyruvate sulfurtransferase (3MST) targeting active-site cysteine persulfide. (2017)
  • Author(s): Hanaoka, K., Sasakura, K., Suwanai, Y., Toma-Fukai, S., Shimamoto, K., Takano, Y., Shibuya, N., Terai, T., Komatsu, T., Ueno, T., Ogasawara, Y., Tsuchiya, Y., Watanabe, Y., Kimura, H., Wang, C., Uchiyama, M., Kojima, H., Okabe, T., Urano, Y., Shimizu, T., Nagano, T.
  • Journal Title: Sci. Rep. Volume: 7 Pages: 40227
  • DOI: 10.1038/srep40227.
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Development of a reversible fluorescent probe for reactive sulfur species, sulfane sulfur, and its biological application. (2017)
  • Author(s): Takano, Y., Hanaoka, K., Shjimamoto, K., Miyamoto, R., Komatsu, T., Ueno, T., Terai, T., Kimura, H., Nagano, T., Urano, Y.
  • Journal Title: Chem. Commun. Volume: 53 Pages: 1064-1067
  • DOI: 10.1039/c6cc08372b.
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Polysulfides (H2Sn) produced from the interaction of hydrogen sulfide (H2S) and nitric oxide (NO) activate TRPA1 channels. (2017)
  • Author(s): Miyamoto, R., Koike, S., Takano, Y., Shibuya, N., Kimura, Y., Hanaoka, K., Urano,Y., Ogasawara, Y., Kimura, H. Polysulfides (H2Sn) produced from the interaction of hydrogen sulfide (H2S) and nitric oxide (NO) activate TRPA1 channels.
  • Journal Title: Sci. Rep Volume: 7 Pages: 45995
  • DOI: 10.1038/srep45995.
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] 3-Mercaptopyruvate sulfurtransferase produces potential redox regulators cysteine- and glutathione-persulfide (Cys-SSH and GSSH) together with signaling molecules H2S2, H2S3 and H2S. (2017)
  • Author(s): Kimura, Y., Koike, S., Shibuya, N., Lefer, D., Ogasawara, Y., Kimura, H.
  • Journal Title: Sci. Rep. Volume: 7 Pages: 10459
  • DOI: 10.1038/s41598-017-11004-7.
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Analysis of endogenous H2S and H2Sn in mouse brain by high-performance liquid chromatography with fluorescence and tandem mass spectrometric detection. (2017)
  • Author(s): Koike, S., Kawamura, K., Kimura, Y., Shibuya, N., Kimura, H., Ogasawara, Y.
  • Journal Title: Free Rad. Biol. Med. Volume: 113 Pages: 355-362
  • DOI: 10.1016/j.freeradbiomed.2017.10.346.
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Hydrogen sulfide and polysulfide signaling (2017)
  • Author(s): Kimura, H.
  • Journal Title: Antioxid. Redox Signal. Volume: 27 Pages: 619-621
  • DOI: 10.1089/ars.2017.7076.
  • Peer Reviewed
• [Presentation] Signaling molecules: H2S and H2Sn. (2017)
  • Author(s): Hideo Kimura
  • Organizer: ConBio2017 神戸
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] 生理活性物質硫化水素とポリサルファイドの産生機構 (2017)
  • Author(s): 渋谷典広
  • Organizer: ConBio2017 神戸
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Mechanism of polysulfide production: enzymatic biosynthesis and chemical interaction between hydrogen sulfide and nitric oxide. (2017)
  • Author(s): Yuka Kimura
  • Organizer: ConBio2017 神戸
  • Int'l Joint Research