2020 Fiscal Year Annual Research Report
Advanced proteomic analysis of signaling pathays mediated by Parkinson's disease-associated kinase PINK1
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17K08635
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| Research Institution | The University of Tokushima |
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Principal Investigator |
小迫 英尊 徳島大学, 先端酵素学研究所(オープンイノベ), 教授 (10291171)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | パーキンソン病 / PINK1 / Parkin / オートファジー / TMT / IP-MS / リン酸化 / PRM |
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| Outline of Annual Research Achievements |
家族性パーキンソン病の原因遺伝子産物として、セリン/スレオニンキナーゼPINK1とユビキチン連結酵素Parkinが知られている。近年、PINK1とParkinが協調して損傷ミトコンドリア上にリン酸化ユビキチン鎖を形成することにより、損傷ミトコンドリア特異的なオートファジー分解を引き起こすことが明らかになった。しかしながら、PINK1の損傷ミトコンドリア上での複合体形成機構やPINK1の下流シグナル伝達経路については不明な点が多い。昨年度までに、TMT (tandem mass tag)標識とIMAC (immobilized metal affinity chromatography)による多検体間比較定量リン酸化プロテオーム解析、および免疫沈降-質量分析（IP-MS）による大規模相互作用解析、さらにin vitroリン酸化アッセイにより、PINK1の直接の基質であり、かつPINK1と相互作用するミトコンドリア外膜タンパク質を見出した。本年度は、PINK1によるリン酸化部位をアラニンまたはアスパラギン酸に置換したリン酸化不能型またはリン酸化模倣型の変異体をMycタグ付きで細胞内に一過的に発現させ、細胞抽出液に対してIP-MS解析を行なったところ、リン酸化によって相互作用が変化するタンパク質の候補が複数同定された。さらにこのミトコンドリア外膜タンパク質に対するsiRNAを用いてノックダウン実験を試みたが、ウェスタンブロットおよびPRM (parallel reaction monitoring)法による精密定量で検討した結果、十分なノックダウン効率が得られていなかった。今後は別のsiRNAを設計すると共に、CRISPR/Cas9によるノックアウト実験も試みる予定である。
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