2017 Fiscal Year Research-status Report

The analysis of HIV transcriptional regulation and development of new HIV drugs

Research Project

Project/Area Number	17K08638
Research Institution	Nagoya City University
Principal Investigator	朝光かおり名古屋市立大学, 大学院医学研究科, 講師 (20381783)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	岡本尚名古屋市立大学, 大学院医学研究科, 教授 (40146600)
Project Period (FY)	2017-04-01 – 2020-03-31
Keywords	転写制御 / HIV
Outline of Annual Research Achievements	ヒト免疫不全ウイルス（HIV）感染症/AIDSは、世界中で約3670万もの人々を苦しめている。現在は抗レトロウイルス療法が行われているが、薬剤耐性ウイルスの出現や潜伏感染ウイルスに効果がないなど、問題点を数多く抱えている。新規作用機序を持つ抗HIV薬の開発が未だ切望されている。そこで、我々は、これらの問題を克服し未だそれを標的とした治療薬が開発されていないHIV遺伝子の転写過程（HIV転写過程）に注目し、研究を行っている。 HIV転写過程とは、HIVプロウイルスからウイルスRNAが産生される過程である。本過程はウイルス産生がみられない潜伏感染状態からHIVの転写活性化を引き起こす初期過程と、爆発的なHIV遺伝子の転写誘導が起こる後期過程に分けられる。 HIV転写初期過程は、宿主の転写因子群の活性のバランスによって制御されている。その主なものの一つに、転写因子NFκBの活性制御が挙げられる。また、HIV転写後期過程は、主にTatとそのコファクターである転写伸長因子P-TEFbによって担われており、HIV転写活性化時には、Tat/P-TEFb複合体が形成されることが必須である。我々の研究目的は、これら2つの転写過程について、メジャーな役割を担う機能分子の活性制御機構を詳細に検討し、最終的には創薬の基盤となる情報を見出すことである。平成29年度は、まず、Tat／P-TEFbの複合体の形成過程について、in silicoでのMDシミュレーションの解析と培養細胞を用いたin vitroアッセイ系を用いて解析を行い、新規HIV薬開発につながる情報を得ることができた。また、NFκB活性制御機構については、新規NFκB相互作用分子NSRP1がHIV-LTRの転写活性化を増強することを見出した。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 平成29年度は、まず、Tat／P-TEFbの複合体の形成過程について、in silicoでのMDシミュレーションの解析と培養細胞を用いたin vitroアッセイ系を用いて解析を行った。まず、Tat分子のMDシミュレーションデータを解析したところ、Tatの20番目のスレオニンアミノ酸残基（T20）と33番目のヒスチジン残基（H33）間で、分子内水素結合が高く保持されていることが分かった。この生物学的重要性を確認するために、タンパク―タンパク間相互作用を測定するFluoppiやHIV-LTRからの転写活性化を測定するルシフェラーゼアッセイを用い検討した。その結果、これらの分子結合はTatの転写活性化に重要な役割を担い、H33が特に重要であることが分かった。また、CDK9のTatの活性制御に重要な領域（ポケット構造）についても、Fluoppiを用い、局所構造の変化がTat/P-TEFbのタンパク間相互作用に与える影響について確認した。その結果、プレリミであるがCDK9のリン酸化がTatとの結合活性を調整する結果が得られた。また、NFκB活性制御機構については、新規NFκB相互作用分子NSRP1がHIVLTRの転写活性化を増強することを見出した。しかしながら、IPウエスタン法を用いてNFκBのサブユニットp65とNSRP1の細胞内での結合を示すことができなかった。そのため、進捗状況の区分として、（2）おおむね順調に進展している、を選択した。
Strategy for Future Research Activity	今年度は、MDシミュレーションデータの解析とそのバリデーションと、NFκB新規相互作用分子NSRP1の活性制御機構について、昨年度に引き続き研究を行う。前者はこのまま研究を続けていけば問題はないと思われるが、後者については、NFκBのサブユニットp65とNSRP1の結合を早急に示す必要がある。実験の変更などを視野に入れ、検討を行う。
Causes of Carryover	(当該助成金が生じた理由）（１）効率的に実験が行われたため、研究試薬の購入額が当初見込みよりも少なかったため。（２）旅費として、当初学会参加と共同研究者との研究打ち合わせを見込んでいた。しかしながら、研究打ち合わせが名古屋で行われたため、このための旅費を必要としなかったため。（使用計画）物品費と論文形成料（その他）に使用する。