2017 Fiscal Year Research-status Report
ATP依存性プロテアーゼによるミトコンドリアマトリクス蛋白質の品質管理機構の解明
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17K08640
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| Research Institution | Iwate Medical University |
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Principal Investigator |
古山 和道 岩手医科大学, 医学部, 教授 (80280874)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
久保田 美子 岩手医科大学, 医学部, 准教授 (30260102)
金子 桐子 岩手医科大学, 医学部, 講師 (10545784)
野村 和美 岩手医科大学, 医学部, 助教 (50733581)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | ATP依存性プロテアーゼ / ミトコンドリア / CLPXP / LONP1 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ミトコンドリアのマトリクスには、CLPXPとLONP1の２種類のATP依存性プロテアーゼが存在する。これらのプロテアーゼはミトコンドリアの機能維持に深く関わることが予想されるが、その役割分担などについては不明な点が多い。これらの２種類のプロテアーゼの基質や基質の認識機構を明らかにすることを目的に、平成29年度においては以下の検討を行った。
1)ヘム生合成系の律速酵素であるALAS1タンパク質がヘム依存性に細胞内でCLPX に認識されることを我々はすでに報告しているが、ALAS１、CLPX、CLPPのそれぞれを組換えタンパク質として発現、精製することに成功し、現在、in vitroにおいてCLPXがALAS1を認識する条件や、組換えCLPXPがin vitroでALAS1を分解するか否かについて検討中である。
2)CLPXPの基質となるタンパク質を同定するため、内在性のCLPXを欠失した293細胞内でFLAG-tagとの融合タンパク質としてCLPXを発現させ、FLAG-tagに対する抗体を用いて免疫沈降を行い、免疫沈降物の中にALAS1タンパク質が含まれることを確認した。今後、ALAS1以外にどのようなタンパク質がCLPXと複合体を形成しているのか、質量分析を用いて確認予定である。LONP1の基質を明らかにするために、CRISPR/Cas9システムを用いてLONP1遺伝子を欠失した細胞の樹立を試みたが、樹立できなかった。この原因として、LONP1の欠失が細胞の生育に大きく影響する可能性が考えられるため、LONP1 cDNAをドキシサイクリン(Dox)誘導性に発現する細胞をまず樹立し、その細胞でDox誘導性にLONP1を発現させながら、内在性のLONP1遺伝子をCRISPR/Cas9システムで欠失させる予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
組換えタンパク質の発現と精製に関してはほぼ当初の予定通りに進行している。CLPXをtagとの融合タンパク質として発現させ、免疫沈降法によりCLPXが認識するタンパク質を分離する手技は確立できたため、今後は予定通り、質量分析を用いた解析に移行する予定である。LONP1欠失細胞については、いまだに樹立に成功していないが、当初想定した範囲内の問題と考えており、解決策を講じて再度進行中である。
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| Strategy for Future Research Activity |
現在のところ、本研究課題は概ね予定通り進行している。今後も当初の研究計画に沿って推進する予定である。実際には、組換えタンパク質として発現・精製したCLPX、 CLPP、ALAS1タンパク質を用いて、in vitroでALAS1がCLPXPにより分解されるかどうかを明らかにする。さらに、ヘム結合型ALAS1やヘム非結合型ALAS1タンパク質、あるいは様々なALAS1変異体と組換えCLPXとの結合性を明らかにすることにより、CLPXの基質認識機構の一端を明らかにする。また、内在性のCLPXを欠失させた細胞内でCLPX-flagタンパク質を誘導性に発現させ、免疫沈降により精製し、免疫沈降物の中にどのようなタンパク質が含まれるのかを明らかにすることにより、CLPXPの基質を同定する。一方、LONP1の細胞内における役割を明らかにするために、CRISPR/Cas9システムを用いて内在性のLONP1を欠失した細胞を樹立する。そのため、まず、ガイドRNAが認識しにくいようにサイレント変異を導入したLONP1 cDNAを作成し、その発現を誘導しながら内在性のLONP1を欠失させる予定である。このような細胞の樹立に成功した場合、この細胞はLONP1を誘導性に発現／欠失が可能になるものと予想している。
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| Causes of Carryover |
次年度使用額として16,963円が生じたが、消耗品として購入を希望していた物品の購入に供するにはわずかに不足であったためで、翌年度分として請求した助成金と合わせて、消耗品を購入する予定である。このため、翌年度分として請求した直接経費の使用用途に大きな変更はない。
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