2019 Fiscal Year Annual Research Report
The protein quality control in mitochondrial matrix by ATP-dependent proteases
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17K08640
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| Research Institution | Iwate Medical University |
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Principal Investigator |
古山 和道 岩手医科大学, 医学部, 教授 (80280874)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
久保田 美子 岩手医科大学, 医学部, 准教授 (30260102)
金子 桐子 岩手医科大学, 医学部, 講師 (10545784)
野村 和美 岩手医科大学, 医学部, 助教 (50733581) [Withdrawn]
鈴木 亘 岩手医科大学, 医学部, 助教 (90610395)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | ATP依存性マトリクスプロテアーゼ / ミトコンドリア / 質量分析 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
最終年度においては、昨年度に引き続き、LONP1欠失細胞の樹立を再度実施せざるを得なかった。昨年度その樹立に成功したと考えていたが、凍結保存していた細胞を再度培養しようとしたところ保存していた５クローンの全てにおいて継代培養が可能な状態にならなかった。樹立時に外来性のLONP1を発現している状態でも生育が極端に遅い状態であったので、LONP1遺伝子の欠失に際して他の遺伝子の発現にも影響を与えてしまっていたものと予想した(off-target effect)。このためゲノム編集のtarget配列を変更し、再度LONP1欠失細胞の樹立を試みた。今年度、新たに樹立したLONP1欠失細胞は昨年樹立したものと同じく、C末端にFLAG-tagを融合させたLONP1タンパク質(LONP1F)をドキシサイクリン(DOX)誘導性に発現する細胞株である。しかし、今年度に樹立したLONP1欠失細胞株は昨年度に樹立したLONP1欠失細胞株と異なり、LONP1Fを発現している間は野生型の細胞と同様に生育したが、LONP1Fの発現が低下すると増殖能が低下した。
これにより、内在性のCLPXを欠失しCLPX-FLAG(CLPXF)を発現するFT293細胞(昨年度までに樹立済み)と、内在性LONP1を欠失し、LONP1Fを発現する細胞が樹立できたので、それぞれのFLAG融合タンパク質を発現させた後に抗FLAG抗体を用いて免疫沈降を行い、それぞれの免疫沈降物(複合体)の構成タンパク質を質量分析装置を用いて同定し、CLPXFとLONP1Fのそれぞれの複合体に含まれるタンパク質の重複の有無について検討を行った。
その結果、CLPXFとLONP1Fの両方の複合体に含まれているタンパク質はほとんどなく、少なくとも通常の培養条件下におけるCLPXPとLONP1の基質は、それぞれ異なる可能性が高いものと推察された。
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