2018 Fiscal Year Research-status Report
| Project/Area Number |
17K08719
|
|---|
| Research Institution | Kyoto University |
|---|
Principal Investigator |
平塚 拓也 京都大学, 医学研究科, 特定講師 (90641639)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
鶴山 竜昭 京都大学, 医学研究科, 特定教授 (00303842)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
|
| Keywords | 病理学 / プロテオーム / トランスレーショナルリサーチ |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、平成30年度においてCD5陽性DLBCLの症例を20例、陰性症例としてCD5陰性ABC type DLBCLの症例を20症例集め、これらの症例について質量分析を行い、CD5陽性DLBCLにおいて発現の上がっているタンパク質、下がっているタンパク質を同定する計画であった。
我々は、まず上記の40症例についての病理所見データベース作成について、まず症例を提供施設と連絡を取り、我々の施設と協力施設において相互に倫理委員会の承認を得るなど研究体制の確立を行った。次いで40症例の選定、収集を行い、病理所見データベースの作成を完成した。
次いで、タンパク質についての質量分析を行うために、FFPE標本からタンパク質を効果的に溶出するためのプロトコールの開発を行った。加熱による架橋の除去法を検討した結果、95 ℃の加熱を180分行うことで、最も高い収量が得られることがわかった。この時、緩衝液pHの違いはタンパク質抽出量を変化させないことがわかった。
タンパク質抽出液組成について検討した結果、20 mM Tris-HCl（pH9),2 % SDS, 1 % β-octyl glycoside, 0.2 M グリシンの組み合わせで最も高い収量が得られた。本組成における精製後の回収量の検討ではDOCを加えることで、より多くのタンパク質が得られた。これらのの検討結果から得た最適な条件によって、DLBCL症例のFFPE標本3検体からタンパク質抽出を行った。その結果、それぞれから47個、245個、524個のタンパク質が同定された。具体的には免疫グロブリン重鎖、CD44などが得られた。同定されたタンパク質は細胞質中に存在する分子が多数同定されたが、上記のような膜タンパク質も20個得られた。タンパク質同定に用いられたペプチドは、各サンプルで少なくとも半数は疎水性であった。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
本研究では、平成30年度においてCD5陽性DLBCLの症例を20例、陰性症例としてCD5陰性ABC type DLBCLの症例を20症例集め、これらの症例について質量分析を行い、CD5陽性DLBCLにおいて発現の上がっているタンパク質、下がっているタンパク質を同定する計画であった。
第一に病理所見データベースは、CD5陽性DLBCLは発生頻度の低い疾患であり、提供施設において、40症例を選定、標本を作製するのに時間がかかった。
次にFFPE標本からタンパク質を効果的に溶出するためのプロトコールの開発については、溶出バッファーの検討を行った。その際に抽出したタンパク質濃度はBradford法、BCA法、ローリー法、2-D Quant kitなど複数の方法にて検討した。しかし、FFPE標本から抽出したタンパク質では化学修飾が加わっており、測定方法によりタンパク質濃度は一致せず、タンパク質濃度測定ができなかった。現在はSDS-PAGEを行い、各サンプルを流したレーンでのtotal intensityを測定している、これにより、サンプル間の相対濃度を測定し、質量分析前にサンプル中のタンパク質濃度をそろえている。この点もまた、今回、研究を進める上で遅れる原因となった。
さらに、タンパク質抽出の効率を高めるために界面活性剤を用いた。界面活性剤の入っている状態では質量分析を行うことはできない。そこで、タンパク質の精製が必要である。そのため、タンパク質抽出量が減少することとなり、現在その点を改善中である。
|
| Strategy for Future Research Activity |
CD5陽性DLBCLの症例を20例、陰性症例としてCD5陰性ABC type DLBCLの症例を20症例集め、これらの症例に関してのデータベースを急ぎ完成させる。また、開発したタンパク質溶出プロトコールによる質量分析を行い、CD5陽性DLBCLにおけるバイオマーカーの探索を行う。
それと並行し、必要に応じて質量分析イメージングを行い、CD5陽性DLBCLに特異的なタンパク質の発現とその領域を調べる。それぞれのたんぱく質の発現領域、発現領域の周囲、発現していない領域に区分し、各区分での マクロファージ、M2型マクロファージの密度、血管の密度、細胞障害性 T細胞、制御性 T細胞の密度を算出する。これにより、細胞密度と、新規に見出したたんぱく質との分布相関を分析し、マクロファージの集簇や細胞障害性T細胞、制御性T細胞の密度との関係など微小環境への影響について明らかにする。
CD5陽性DLBCLと対照群であるCD5陰性ABC type DLBCLを、質量分析にて検出されたたんぱく質分子の発現の有無によりそれぞれ陽性群と陰性群の4群に分類する。それぞれ検出されたたんぱく質について、各々4群において初診時における非ホジキンリンパ腫の国際予後指数（年齢、血清LDH、Performance Status、病期、節外病変数）を比較検討し、予後に関する新規バイオマーカーを探索する。また、陽性群と陰性群での節外臓器への進展の有無、中枢神経再発の有無についても比較検討する。これにより、新たに病理診断に有効な予後因子を同定する。
|
| Causes of Carryover |
FFPE標本からタンパク質を効果的に溶出するためのプロトコールの開発については、溶出バッファーの検討を行った。その際に抽出したタンパク質濃度はBradford法、BCA法、ローリー法、2-D Quant kitなど複数の方法にて検討したが、FFPE標本から抽出したタンパク質では化学修飾が加わっており、測定方法によりタンパク質濃度が一致せず、そのためタンパク質濃度測定ができなかった。また、タンパク質抽出の効率を高めるために界面活性剤を用いた。界面活性剤の入っている状態では質量分析を行うことはできない。そこで、タンパク質の精製が必要である。しかし、過程が増えるとタンパク質抽出量が減少することとなり、そのために実験に遅れが生じ、予定していた質量分析、その結果に基づいた免疫染色を行うことが次年度に持ち越しとなった。
上記の理由にて、生じた次年度使用額を用いて、CD5陽性DLBCLのFFPE標本を用いた質量分析やそれで同定されたタンパク質について免疫染色を用いた微小環境の解析などを行う予定をしている。
|
