2017 Fiscal Year Research-status Report
Dysregulation of AKT network and its application for precision medicine in lung cancer
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17K08727
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| Research Institution | Jichi Medical University |
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Principal Investigator |
土橋 洋 自治医科大学, 医学部, 准教授 (90231456)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
北川 雅敏 浜松医科大学, 医学部, 教授 (50294971)
坪地 宏嘉 自治医科大学, 医学部, 教授 (50406055)
後藤 明輝 秋田大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (90317090)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 肺癌 / Akt / mTOR / p27 / 遺伝子増幅 / ubiquitin ligase / TFF-1 / ELISA |
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| Outline of Annual Research Achievements |
肺癌において、増殖シグナルeffctorのAktを中心とした活性化制御異常を解析した。
1. 細胞周期抑制因子p27はAkt以外にubiquitin ligase により分解制御される。93症例 (全組織型) の肺癌組織でp27とligaseの発現を免疫染色で検索した。Skp2は扁平上皮癌、小細胞癌で、Pirh2, KPCは非小細胞癌で発現が高頻度だった。臨床病理学的に腺癌でKPC発現はT因子、Pirh2はpN, pStageと、扁平上皮癌で細胞質p27はpNと有意な相関を示した。Pirh2は腺癌では予後と相関し、組織型特異的p27制御機構と、ligaseの悪性度規定因子としての有用性を示し、論文誌上発表した。
2. MLPA(Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification)法のAKT1, AKT2のカスタムプローブを独自合成し、遺伝子数を定量解析した。cut-off値も独自で再設定し、腫瘍内不均一性を克服できるレベルで解析できることをFISH解析との同時解析で確認した。研究協力者の金沢大学のグループと欧米雑誌への論文執筆中である。
3. mTORに抑制される蛋白としてmicroarray 解析でTrefoil factor-1(TFF-1)を同定した。免疫染色でmTORとTFF-1は拮抗的な発現を示した。またTFF-1 promotor導入Luciferase vectorを用いた培養細胞系で、mTOR抑制剤によりTFF-1 promotor活性が亢進し、in vitro, in vivo両系でmTOR-TFF-1の制御を確認した。患者血清レベルのELISAによる定量解析系を東大・野村(連携研究者)らが確立し、我々は尿中レベルの解析系も確立した。結果、肺癌患者では血清、尿中いずれでもTFF-1が高い事を確認した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
1. p27のAktによるリン酸化制御とは別のubiquitin ligase による分解制御という観点から、組織型特異的なp27制御機構のみならず、ligaseの悪性度の規定因子としての有用性が示された。順調に2017年に論文誌上発表できた((Hum Pathol, 2017)。
2. MLPA法のカスタムプローブによる遺伝子数の定量解析は、世界でもまだ普及しておらず、未開の技術であったが、研究協力者である金沢大学・分子病理学講座・大井教授のグループとの連携で論文投稿へ準備が整った。
3. mTOR-TFF-1の系では、培養細胞とヒト肺癌組織の両系でmicroarray解析の結果が証明された。理科学研究所細胞銀行やATTCから購入した多種の培養細胞株では、多種の技術的アプローチ(Luciferase assay, immunoblotting, ELISA)で矛盾しないデータが得られ、順調な進捗と考えている。また、臨床病理学的アプローチとして肺癌組織、培養細胞、患者血清の解析も同時進行したが、これらでも非常に興味深いデータが得られている。
4. 予定していた研究補助員が雇用できなかったために、計画の進行は必ずしも当初に計画していたものとは異なり、臨床病理学的解析を優先に進めた。
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| Strategy for Future Research Activity |
1. 前年度までにAKT1、AKT2関連miR(miR-200a)のターゲットとして肺癌組織で解析したEphA2について、培養細胞でAKT2を高発現、ノックアウトし、EphA2の動態変化に関するvalidationを行う。miR200a, EphA2のinsitu hyvridizationによる解析も共同研究者(秋田大学・後藤)と計画中である。
2. TFF-1の解析は、東大・消化器外科と共同で、患者血清と培養細胞の両面からのELISA解析と組織切片上での免疫染色を平行した解析を継続する。更に、純粋な陰性対象として健常人100例(予定)の血清、尿を文科省・学術研究支援・生命科学連携推進協議会の支援により供与されることとなり、これも加えた解析を継続する。合成TFF-1 promoter のluciferase assay はmTOR siRNA(Cell Signaling Tech. 社製を購入予定)で抑制をかけて、rapamycinによる結果のvalidationを行う。更に、TFF-1のexpression vector (CMV promotor 制御下, TaKaRa Bio.製vectorを使用予定)も合成し、肺癌培養細胞株に導入して形質変化を解析する。
3. p27とubiquitin ligaseの解析は, 既述のようにAKTの実験系で成功したMLPAのプロトコールでcustom-made probeを合成し、Skp2, KPC-1, Pirh2の3種ubiquitin ligaseの遺伝子増加との関連を解析する。probe sequenceはGene Atlasよりデザインを開始した。
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| Causes of Carryover |
1. 前年度までの課題を1年延長し、2017年度にも研究を継続した。本課題はその内の発展であり、かつ前年度までに購入した試薬を使用できた部分があり、今年度は繰越金が生じた。これは、共同研究者も同様であり、今年度の消耗品費の使用額が少なかった。2018年度は、分子生物学的解析が主体となり、特にTFF-1のcoding sequenceのDNA合成やそのexpression vectorを用いた培養細胞への導入実験が増えるため、繰越金を使用して更なる成果をあげる計画である。
2. 予定していた研究補助者が採用できなかったため、その人件費分が消費されなかった。2018年度は研究補助者を採用したい。
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Research Products
(6 results)
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[Journal Article] Gene amplification of CCNE1, CCND1 and CDK6 in gastric cancers detected by multiplex ligation-dependent probe amplification and fluorescence in situ hybridization.2017
Author(s)
Ooi, A., Oyama, T., Nakamura, R., Ikeda, H., Fushida, S. and Dobashi, Y.
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Journal Title
Hum Pathol
Volume: 61
Pages: 58-67
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] The low expression of miR-451 predicts a worse prognosis in non-small cell lung cancer cases.2017
Author(s)
Goto A, Tanaka M, Yoshida M, Umakoshi M, Nanjo H, Shiraishi K, Saito M, Kohno T, Kuriyama S, Konno H, Imai K, Saito H, Minamiya Y, Maeda D.
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Journal Title
PLoS One
Volume: 12
Pages: e0181270
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Homeobox transcription factor NKX2-1 promotes Cyclin D1 transcription in lung adenocarcinomas.2017
Author(s)
Harada M, Sakai S, Ohhata T, Kitagawa K, Mikamo M, Nishimoto K, Uchida C, Niida H, Kotake Y, Sugimura H, Suda T, Kitagawa M
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Journal Title
Mol Can Res
Volume: 15
Pages: 1388- 97
DOI
Peer Reviewed
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