2020 Fiscal Year Research-status Report
Dysregulation of AKT network and its application for precision medicine in lung cancer
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17K08727
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| Research Institution | International University of Health and Welfare |
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Principal Investigator |
土橋 洋 国際医療福祉大学, 国際医療福祉大学病院, 教授 (90231456)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
北川 雅敏 浜松医科大学, 医学部, 教授 (50294971)
坪地 宏嘉 自治医科大学, 医学部, 教授 (50406055)
後藤 明輝 秋田大学, 医学系研究科, 教授 (90317090)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | TFF-1 / 肺癌 / 増殖抑制 / 浸潤抑制 / abortive cell cycle / mTOR |
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| Outline of Annual Research Achievements |
我々はヒト肺癌でmammalian Target of Rapamycin (mTOR)により発現抑制される新規分子としてmicroarrayからTrefoil factor-1 (TFF-1)を抽出した。本年度は培養細胞の系でTFF-1の機能を解析した。
[方法]1. 全組織型の肺癌培養細胞株12種、新たに樹立したTFF-1過剰発現株2種を用い、immunoblot、定量RT-PCR、ELISAでTFF-1の細胞内発現、細胞外分泌量を定量した。2. TFF-1の全長cDNA導入ベクターで2種の細胞に構成的過剰発現させ、細胞数カウント、Viability/ Cytotoxicity assayで増殖能、細胞死の解析を、flow cytometryで細胞周期の変化、更に遊走能(wound healing assay)、浸潤能(matrigel assay) への影響を解析した。[結果]1. 内因性TFF-1は上記1.の3種の解析法いずれでも肺腺癌細胞株のみで発現、分泌があり、他の細胞では確認できなかった。2. TFF-1過剰発現株ではいずれの解析法でも細胞分裂は亢進するが細胞死も亢進し、増殖能は相対的に抑制された。かつ細胞周期の解析で、TFF-1発現株ではS-G2/M期分画が増加、G1期は減少し、abortive cell cycleが示唆された。3. TFF-1過剰発現株では遊走能/浸潤能も有意に低下し、これはTFF-1特異的siRNAの導入で回避された。 [結論] TFF-1は肺癌で組織型特異的に発現し、分泌される。またabortive cell cycleにより細胞死を亢進、増殖/浸潤能/遊走能を抑制すると考えられた。TFF-1の腫瘍抑制機能が治療に応用でき、またTFF-1分泌レベルは肺癌患者で腺癌のバイオマーカーとなる可能性も示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
我々が見出した、mTORの発現により変動する蛋白質であるTFF-1とそのファミリーに関してヒト肺癌と培養細胞の両系でその機能とバイオマーカーとしての有用性を解析するのが本研究の目的である。その観点から、
1. 肺癌、非腫瘍性肺疾患患者、健常者の血清、尿のTFF定量は昨年度まで検体採取数、解析数ともに順調な進捗状況であった。また、術後患者のTFFの定量も経時的に開始したが、これに関しては症例数がまだ少なく、統計解析するレベルに達していないので、引き続きこの検体採取を進める。同時に、すべての患者の手術材料の病理組織切片も作成済みである。一部症例でTFF-1,2,3の特異抗体による免疫染色検索した結果、血清、尿中、あるいは培養細胞での動態とやや異なった結果を得ており、更に解析を進めている状況である。
2. 肺癌培養細胞における解析は上記のようにTFF-1過剰発現株や種々の手法で発現、転写、増殖、浸潤の解析が進み良好な結果を得た。更に、細胞周期や細胞死の機序の解析も予定通り進行した。蛋白レベルでの発現解析も順調だったが、現段階では血清、尿中レベルと密接に関わると推定される細胞外分泌レベルの詳細な解析が未検である。
3. mTORによるTFF-1の転写レベルでの制御まではluciferase assay等で明らかにしたが、その系に介在する転写因子の解析に難渋している。因子が多数存在することに加え、市販の転写解析解析試薬が一部入手困難な状況もあったが状況は改善している(後述)。
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| Strategy for Future Research Activity |
1. 血清、尿中TFF1-3の定量については統計的に有意なレベルとしての肺癌患者数とそれにマッチさせた健常者各200検体については終了し、有意差も得たが、その他の病的対照群としての非腫瘍性肺疾患検体が現在61例であり、統計的有意水準に達するまで可能な限り採取を継続する。更に肺癌とTFFの直接的関係を確認するために、術後1, 3, 6, 12か月の定期検査時に採取している。検体数が予定通りに増えず、この検索のために研究延長の倫理申請も行ったので、期間内に更に検体採取を続け、解析を終了させる。
2. 手術材料の病理組織切片を用いた検索は染色を完了したので1.のデータ、臨床病理学的側面との詳細な対照解析を行う。
3. TFF-1の転写制御解析は候補因子が多数あり、蛍光抗体法染色によるスクリーニングと各転写因子に対する発現、活性アッセイキットを用いてHNF-4, c/EBP, GATA-3, GATA-6を解析した。その結果、組織型により責任転写因子が異なる可能性が明らかになり、特に腺癌に関してはドライバー遺伝子との関連も含めて解析する。これは令和2年度より助成された研究課題とも関連する事項なのでそちらでも継続する。
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| Causes of Carryover |
1. 本研究の２年目に、術後患者の検体も定期検査時に採取して、アッセイする計画を追加した。この解析はTFF1-3のバイオマーカーとしての有用性の評価であるが、術後の局所の炎症等の影響によりTFFが変動する可能性も考慮し、術後12か月まで継続する計画とした。しかし実際には、術後患者に追加治療が施行されて病態に修飾が加わったため、解析対象から除いた症例がある。また、非腫瘍性肺疾患の検体数が若干少ないので、この収集を加えて期間内に終了できる予定である。基本的に現有の機器、試薬でほぼ行えるので高額な消耗品費は必要としない。
2. TFF-1の転写制御因子を複数解析中だが、使用していた、あるいは使用予定であった製品がコロナの影響もあり、納品、解析が遅れた。他のkitの購入、あるいは納品の再開によって解析可能な状態となっているのでその後の進捗は順調である。ELISA kit, 特異抗体等を使用する実験で、いずれも高額であるが研究費の残額で賄える範囲である。
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