2018 Fiscal Year Research-status Report
ジスルフィド結合を介したタイト結合機能調節：細胞増殖因子としての機能解明
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17K08735
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
田中 敏 北海道大学, 医学研究院, 特任准教授 (30374250)
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2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | タイト結合 / redox / ジスルフィド結合 / ユビキチン / thioredoxin |
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| Outline of Annual Research Achievements |
Occludin-FLAGの野生型やシステイン(Cys)変異型をAMOC2細胞株に発現させて、様々な条件下でのoccludin-FLAGの安定性やジスルフィド結合の有無、HIF-1やユビキチンE3リガーゼITCHによるoccludin分解の制御について検討した。
SH基修飾試薬を用いた検討では、occludinに含まれる７か所のCysのうち、細胞外ループ上にあるCys216とCys237に分子内、もしくは分子間のジスルフィド結合が存在することが確認された。また、Cys409、Cys500については安定したジスルフィド結合が存在しないことが確認されるとともに、occludin中の遊離した状態のCysはCys409とCys500のみであると確認された。同時にCys74、Cys82、Cys148についてはSH基修飾試薬と反応性がないことから、細胞膜内で分子間のジスルフィド結合を形成している可能性が考えられた。
塩化コバルト処理によるHIF-1分解阻害条件下でoccludin-FLAGは、野生型に比べてCys216やCys237変異型でより分解が亢進していた。その一方、ユビキチンE3リガーゼITCH認識配列を変異させたoccludin-FLAGでは、塩化コバルト処理によるoccludin分解が抑制され、さらにCys216やCys237変異型の分解が野生型より亢進していなかった。以上のことから、occludinの低酸素での分解にはHIF-1とITCHを介したユビキチン化が影響することが推測された。また、Cys409、Cys500は酸化されやすいことから、occludinの細胞へのシグナル伝達に何らかの役割を担っている可能性が考えられた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
Occludinとジスルフィド結合、低酸素、塩化コバルトの検討が進んでいる。特に２か所のCysを変異させたoccludinについてSH基修飾試薬を用いた検討を進め、ジスルフィド結合の部位など、現在までに得られた結果の再確認がなされた。また、低酸素だけでなく塩化コバルトによるoccludin分解を観測することにより、HIF-1のoccludin分解への役割を確認できた。しかし、occludinと細胞増殖との関係が解明できていないのと、最終的な目標であるthioredoxinとの関係性の解明は進んでいない。以上を総合して、おおむね順調に進展していると考えた。
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| Strategy for Future Research Activity |
Occludin-FLAG発現細胞を様々な条件下で培養し、occludinの安定性と細胞増殖性の関連を検討する。また、HIF-1やITCHによるユビキチン化によるシグナル経路とoccludinの関連を解明するために、塩化コバルトも用いて細胞増殖性の測定を行う。
OccludinのCys216、cys237、Cys409、Cys500についてはthioredoxinと相互作用する可能性が高く、共免疫沈降と質量分析でthioredoxinの特定を試みる。
Cys74、Cys82、Cys148については、他のoccludinやtricellulin、claudin、JAMなどとの分子間のジスルフィド結合が存在するか、種々のCys変異型occludin-FLAGとの共免疫沈降により検出を試みる。
OccludinのCys変異がタイト結合機能へ及ぼす影響、特に細胞間隙物質透過性について検討する。
他のタイト結合膜蛋白（tricellulin、MARVEL D3、claudin、JAM）についても同様の検討を行い、比較検討する。
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