2017 Fiscal Year Research-status Report
Multifaceted approach for understanding of malignant phenotype of glioblastoma
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17K08764
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| Research Institution | University of Miyazaki |
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Principal Investigator |
福島 剛 宮崎大学, 医学部, 助教 (10452913)
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2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 膠芽腫 / 浸潤性増殖 / CD24 / MALAT1 / MET / 細胞周囲微少環境 / プロテアーゼ活性制御 / IGFBP2 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
膠芽腫は、治療標的に関わるブレークスルーが最も待望されている難治性がんである。本研究は網羅的解析と機能解析の両面から膠芽腫の悪性形質を左右する新たな機能遺伝子を見出すことを目的とする。特に、これまで我々が様々ながんで得てきたプロテアーゼ活性調節による細胞周囲微小環境制御に関する知見が膠芽腫にも当てはまるのか検証する。
本研究では、網羅的解析を基に解析対象として見出した CD24、MALAT1、MET に着目して進めている。様々な悪性腫瘍での発現と、浸潤や不良予後との関連が報告されているGPI アンカー型糖蛋白である CD24については、幹細胞性や分化への関与、エクソソームとの関連を解析している。培養上清からエクソソームを濃縮し、miRNA を含む total RNA を抽出する方法を確立し、現在、CD24 の発現とエクソソームmiRNA プロファイルの関連を調べるマイクロアレイを準備している。肺癌を初めとする悪性腫瘍との関連が報告されている 長鎖非翻訳RNA である MALAT1については、膠芽腫細胞株において antisense LNA (locked nucleic acid) を用いたノックダウンに成功し、増殖、細胞周期、アポトーシス抵抗性、浸潤への影響を解析している。肝細胞増殖因子（HGF）の特異的受容体チロシンキナーゼである MET については、細胞外環境におけるプロテアーゼ活性化機構、特に膠芽腫細胞でしばしば発現している HGF activator の活性調節、中枢神経系の組織で発現が見られる HAI-2 (HGF activator inhibitor type 2)との関連を中心に解析を進めている。膠芽腫、星状膠細胞でのDNA メチル化状態を解析し、多くの膠芽腫において DNA メチル化によって HAI-2の発現が抑制されていることを確認した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
細胞が弱らず、かつ、培養容器がコンフルエントにならない状態で培養上清を回収し、そこから解析に足る質と量を満たすエクソソームを得る方法を確立するのに困難をきたした。様々な培養方法やエクソソームの濃縮方法を試し、結局、あらかじめ超遠心を行って牛由来のエクソソームを取り除いた血清を用いて培養し、超遠心分離法で培養上清を濃縮、さらに洗浄する方法で解析できる状態を確保した。また、エクソソーム由来の miRNA が微量でも解析できる感度の高いマイクロアレイを準備した。
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| Strategy for Future Research Activity |
2種類の膠芽腫細胞（U251 と YKG-1）、細胞抽出 RNA とエクソソーム抽出 RNA、コントロール株と CD24 抑制株、のそれぞれの組合せ（計8サンプル）について 受託解析で miRNA アレイ（アジレントSurePrint G3 Human miRNA 8x60K）を行い、解析対象とする miRNA を絞り込むとともに、すでに得ている CD24 発現変動に伴う mRNA 発現プロファイルと合わせて、膠芽腫における遺伝子発現制御のメカニズムを解析する。絞り込んだ miRNA については、Mir-X miRNA qRT-PCR Kit (TaKaRa) を用いて定量し、細胞やエクソソームでの発現や CD24 との連動を確認する。また、解析意義があると考えられた miRNA については、CD24 との関係のみならず、MALAT1 や MET シグナル関連因子との関係も検討する。
マウス脳からの astrocyte 初代培養、不死化細胞樹立方法の確立を急ぐ。また、HGF/MET シグナル関連因子の解析のためにマウス脳からの蛋白抽出方法や immunoblot 条件を確立する。
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