2017 Fiscal Year Research-status Report

自閉症原因遺伝子NLGN4Xの発現変化に起因する分子病態の解析

Research Project

Project/Area Number	17K08778
Research Institution	Institute for Developmental Research, Aichi Human Service Center
Principal Investigator	飯尾明生愛知県心身障害者コロニー発達障害研究所, 発生障害学部, 客員研究者 (80344349)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	松木亨愛知県心身障害者コロニー発達障害研究所, 発生障害学部, 主任研究員 (90332329) 上田昌史愛知県心身障害者コロニー発達障害研究所, 発生障害学部, リサーチレジデント (90791541)
Project Period (FY)	2017-04-01 – 2021-03-31
Keywords	NLGN4X / 自閉症 / エピジェネティックス / MeCP2 / iPSC / CpGメチル化 / AVP / 逆鎖NLGN4X
Outline of Annual Research Achievements	本研究は、ヒト自閉症原因遺伝子ニューロリギン4X(NLGN4X)について、自閉症での遺伝子発現の変化の有無、その発現の増減を引き起こす非遺伝的背景（エピジェネティックス、環境要因）とそれによって引き起こされる分子病態を明らかにし、自閉症発症のメカニズムの解明や、発現量を指標とした新規診断法、及び発現調節を標的にした治療法の確立とQOLの改善を目的としている。本年度は平成28年度基盤研究C「自閉症高感受性遺伝子ニューロリギン4Xのエピジェネティックな発現制御機構の解析」に引き続きメチル化を主体としたエピジェネティックな発現制御機構の解明と、NLGN4Xを介したホルモン分泌制御機構の解析を行った。まず、NLGN4Xの発現が抑制されている細胞でのユビキタスな発現抑制メカニズムを調べるため、HeLa細胞の他にHepG2細胞のプロモーターCpGメチル化を検討したところ、CGIプロモーター領域はHeLa細胞程ではないが広くメチル化されているのに対し、コアプロモーターはメチル化が弱く発現抑制についてメチル化以外の要因が考えられた。また、逆鎖NLGN4X RNAの発現制御プロモーターの同定のため、転写開始点から上流2kb, 下流3kbをレポーターベクターにつなぎレポーターアッセイしたところ、非常に低い活性しか検出できなかったため、コアプロモーターの同定に至らなかった。次にNLGN4XのリガンドNRXN2βの作用によるAVP分泌量の変化を調べたところ、可溶性NRXN2βでは影響が見られなかったため、膜型NRXN2βに変更して解析する予定である。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 前回と同様、コアプロモーター領域のCpGメチル化解析が難航し時間を要してしまった。また、可溶性NRXN2βによるAVP分泌変化の解析がうまくいかず、膜型、クラスタリング活性の付与など検討する必要が生じた。逆鎖NLGN4Xのプロモーター活性が低く、コア領域の特定に至っていない。
Strategy for Future Research Activity	30年度は引き続きプロモーターのCpGメチル化解析をNLGN4X発現細胞/ NLGN4X非発現細胞で継続し、発現抑制、発現促進におけるユビキタスなメチル化プロファイルを明らかにするとともに、CRISPR-CAS9システムを用いたジーンドライブにより、NLGN4X非発現細胞でのNLGN4X発現活性化、NLGN4X発現細胞での発現不活性化を人為的にコントロールし、神経突起の形状、ホルモン分泌、シナプス活動などの表現型にどのような影響がみられるか検討する。また、Sp1,CEBPsなどMeCP2以外の転写制御因子によるプロモーターのChIP解析を行い、クロマチンレベルでの発現制御プロファイルを明らかにする。一方、NRXN2βを膜に発現するHEK293細胞との共培養によりAVP発現に変化が見られないか検討するとともに、グルカゴン産生細胞、NK細胞でのNLGN4Xの発現の確認、アドレナリン産生クロム親和性細胞でのNLGN4Xの発現の確認とアドレナリン産生への影響の有無を検討する。
Causes of Carryover	コアプロモーターのCpGメチル化解析が難航し、可溶性NRXN2βによるAVP分泌制御の解析が不調に終わり、逆鎖NLGN4X-RNAのプロモーター解析が進展しなかったため、その後のChIP解析、ジーンドライブの準備が遅延した。本年度は前年度行う予定であった当研究を繰り越して実施するため、当該年度予算にそのまま繰り越して使用する予定である。