2019 Fiscal Year Research-status Report

自閉症原因遺伝子NLGN4Xの発現変化に起因する分子病態の解析

Research Project

Project/Area Number	17K08778
Research Institution	Institute for Developmental Research Aichi Developmental Disability Center
Principal Investigator	飯尾明生愛知県医療療育総合センター発達障害研究所, 細胞病態研究部, 客員研究者 (80344349)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	松木亨愛知県医療療育総合センター発達障害研究所, 細胞病態研究部, 主任研究員 (90332329) 上田昌史愛知県医療療育総合センター発達障害研究所, 細胞病態研究部, リサーチレジデント (90791541)
Project Period (FY)	2017-04-01 – 2021-03-31
Keywords	NLGN4X / 自閉症 / エピジェネティックス / CpGメチル化 / AVP / CEBP / Sp1 / iPSC
Outline of Annual Research Achievements	本研究は、ヒト自閉症原因遺伝子ニューロリギン4X(NLGN4X)について、自閉症での遺伝子発現の変化の有無、その発現の増減を引き起こす非遺伝的背景（エピジェネティックス、環境要因）とそれによって引き起こされる分子病態を明らかにし、自閉症発症のメカニズムの解明や、発現量を指標とした新規診断法、及び発現調節を標的にした治療法の確立とQOLの改善を目的としている。本年度も昨年度から引き続きプロモーターゲノム領域のメチル化を中心としたエピジェネティックな発現制御機構の解明と、ニューレキシンや他の結合因子を介したバソプレッシン分泌制御機構の解析を行った。まずコアプロモーター及びCGIプロモーターに対するSp1およびCEBPsのChIP解析を行ったところ、コアプロモーターにはCEBPα,β及びδ、Sp1が、CGIプロモーター近傍にはSp1がそれぞれ結合し転写調節に関与していることが示唆された。コアプロモーターについてはCEBPsがプロモーター活性を正に調節していることがルシフェラーゼアッセイによって確かめられた。次にバソプレッシン分泌細胞で発現するニューレキシンサブクラスを調べたところNRXN1α＞NRXN2βであることがわかった。分泌型NRXN1α-Fcを細胞に作用させたところcAMPの上昇が見られたことからシグナルが伝わっていることが示唆された。逆にNLGN4XとNRXNの結合をmimicするmimetic peptideを作製し細胞に作用させたところcAMP上昇が認められた。分泌経路関連分子の中でNLGN4Xと相互作用する可能性のある分子をスクリーニングしたところSyntaxin-1Aが見出された。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason CEBPs及びSp１抗体を用いたChIPアッセイのバックグランドが高かったため解析に時間を要した。また、MSP-qPCRについてもAT-richなため条件検討が必要であった。年度前半は新研究所移行に伴う再セットアップに時間を要し、年度終盤はコロナウイルス状況下で再解析や新規実験のセットアップ等を自粛した。
Strategy for Future Research Activity	最終年度は前年度自粛により実施しなかったiPSC肝細胞分化系を用いた解析を行い、NLGN4X発現細胞/非発現細胞におけるプロモーターメチル化プロファイルを整理し、NLGN4Xの発現と神経系細胞分化の相関関係について論文にまとめる。また、CRISPR-CAS9システムを用いたエピゲノム編集ジーンドライブによるメチル化のON/OFFによって発現が調節されるかどうか検証する。一方、バソプレッシン分泌制御機構におけるNLGN4X-NRXNs相互作用、NLGN4X-分泌経路関連分子相互作用について、近接分子間相互作用可視化によって明らかにする。
Causes of Carryover	本年２、３月時のコロナウイルスが広まる状況下での新規購入、新しい実験系の立ち上げを控えたため、次年度に繰り越した。本年度にiPSCからの肝細胞分化誘導系を新たに立ち上げ、非神経細胞分化時のNLGN4X発現制御機構の解析を実施する予定である。