寄生虫感染時の宿主翻訳制御におけるP-bodyの役割

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17K08782
• Research Institution: Gunma University
• Principal Investigator: 瀬戸 絵理 群馬大学, 大学院医学系研究科, 助教 (40431382)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: 感染応答 / mRNP / P-body / Trypanosoma cruzi

Outline of Annual Research Achievements

Processing body (P-body)は真核生物におけるRNA顆粒（mRNA-蛋白質複合体）のひとつで、mRNA分解などの翻訳制御機能をもつ。これまでの研究で、寄生原虫Trypanosoma cruzi (T.cruzi )の感染初期に宿主細胞でP-bodyの形成が誘導されることを見出だした。またsiRNAによってP-bodyをノックダウンした細胞では、T. cruzi の侵入および増殖が亢進した。このことから、感染により誘導されるP-bodyが感染防御応答遺伝子の翻訳調節に重要な役割を果たしている可能性を考えた。そこで、感染時特異的にP-bodyにリクルートされてくる遺伝子の網羅的同定を試みた。感染細胞から遠心分画法によってRNA顆粒を分画し、その画分に複数のP-body構成蛋白質およびcDNAライブラリの作製に適した純度のRNAが濃縮されてくることを確認した。また CRISPR/Cas9ゲノム編集システムを用いてP-bodyの必須構成蛋白質であるEDC4をノックアウトした細胞株を樹立した。ノックアウト細胞とコントロール細胞にT. cruziを感染させ、遺伝子発現パターンの経時的な変化を次世代シーケンス解析で比較した。その結果、ノックアウト細胞では複数の自然免疫応答関連遺伝子の発現誘導パターンがコントロール細胞と異なることが示された。このことから、これらのターゲット遺伝子が感染時にP-bodyによって発現調節を受けている可能性が示された。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

新型コロナウイルス感染症の影響により、研究活動に様々な支障が生じたことから、研究は当初の計画より遅れている。

Strategy for Future Research Activity

感染細胞と非感染細胞から分画精製したP-bodyからRNAを抽出しcDNAライブラリを作製する。そして次世代シーケンシングやマイクロアレイを用いた比較解析により、感染時特異的にP-bodyで翻訳調節を受ける遺伝子の同定を試みる。
またP-bodyノックアウト細胞への感染でコントロールと比較して発現パターンに変化があった遺伝子について、コントロール細胞でのP-bodyとの共局在をin situハイブリダイゼーション法および免疫染色法を用いて調べる。共局在が確認できた場合、P-bodyへの取り込みが感染によって変化するかどうか、感染後経時的に分画したP-body画分からRNAを抽出して定量PCR法により調べる。

Causes of Carryover

研究活動の遅れにより精製したP-body画分からのライブラリ調整を年度内に行えなかったため、未使用額が生じた。令和3年度の経費の主な用途は消耗品である。その内訳は細胞培養に必要な培地、血清、デイッシュなどのプラスチック製品、ガラス器具、抗体、オリゴ作製費、試薬類である。また国内学会で研究成果を発表するために必要な旅費も使用予定である。