寄生虫感染時の宿主翻訳制御におけるP-bodyの役割

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17K08782
• Research Institution: Gunma University
• Principal Investigator: 瀬戸 絵理 群馬大学, 大学院医学系研究科, 助教 (40431382)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: 感染応答 / RNA顆粒 / P-body / Trypanosoma cruzi

Outline of Annual Research Achievements

Processing body (P-body)は真核生物におけるRNA顆粒（mRNA-蛋白質複合体）のひとつで、mRNA分解などの翻訳制御機能をもつ。これまでの研究で、寄生原虫Trypanosoma cruzi (T.cruzi)の感染初期に宿主細胞でP-bodyの形成が誘導されることを見出だした。またsiRNAによってP-bodyをノックダウンした細胞では、T. cruziの侵入および増殖が亢進した。このことから、感染により誘導されるP-bodyが感染防御応答遺伝子の翻訳調節に重要な役割を果たしている可能性を考えた。そこで、CRISPR/Cas9ゲノム編集システムを用いてP-bodyの必須構成蛋白質であるEDC4をノックアウトした細胞株を樹立した。ノックアウト細胞とコントロール細胞にT. cruziを感染させ、遺伝子発現パターンの経時的な変化を次世代シーケンス解析で比較した。その結果、ノックアウト細胞では複数の自然免疫応答関連遺伝子の発現がコントロール細胞と比較して有意に上昇していた。またノックアウト細胞への野生型EDC4レスキューによりこれらの遺伝子の発現は抑制されたが、P-body形成に必須な領域を欠損した変異型EDC4のレスキューでは抑制がおきなかった。これらの結果からEDC4のP-bodyへの局在がターゲット遺伝子の発現抑制に必須であることがわかった。続いてこれらのターゲット遺伝子がPBへの取り込みにより直接的に制御されているかどうかを調べるため、レスキュー細胞から野生型もしくは変異型EDC4の免疫沈降を行なった。今後、沈降サンプルからRNAを抽出し、定量PCR法によりターゲット遺伝子の共沈の有無を確認予定である。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

新型コロナウイルス感染症の影響により、研究活動に様々な支障が生じたことから、研究は当初の計画より遅れている。

Strategy for Future Research Activity

P-bodyノックアウト細胞への感染でコントロールと比較して発現が変動した遺伝子について、P-bodyとの共局在を免疫沈降法やin situハイブリダイゼーション法などを用いて調べる。共局在が確認できた場合、P-bodyへの取り込みが感染によって変化するかどうか、感染後経時的に分画したP-body画分からRNAを抽出して定量PCR法により調べる。またターゲット遺伝子のノックアウトまたはノックダウンがT. cruziの侵入や増殖に及ぼす影響を調べる。

Causes of Carryover

研究活動の遅れによりターゲット遺伝子の局在確認実験を年度内に行えなかったため、未使用額が生じた。令和4年度の経費の主な用途は消耗品である。その内訳は細胞培養に必要な培地、血清、ディッシュなどのプラスチック製品、ガラス器具、抗体、オリゴ作製費、試薬類である。また国内学会で研究成果を発表するために必要な旅費も使用予定である。