アポリポ蛋白Ｅ遺伝子欠損ウサギモデルを用いたアポＥの機能解析

2017 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17K08783
• Research Institution: University of Yamanashi
• Principal Investigator: 新見 学 山梨大学, 大学院総合研究部, 助教 (80644898)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: アポリポ蛋白E / 脂質代謝 / ウサギ / ノックアウト / ゲノム編集

Outline of Annual Research Achievements

1. PCRによる簡便なジェノタイピング法の確立
本研究で用いるアポE欠損ウサギはCas9システムによるゲノム編集で13塩基を欠失させたモデルである（Yang D et al., 2013; Niimi M et al., 2016）。これまでウサギ産仔のジェノタイピングはゲノムDNAシークエンスにより行われてきた。in vivo実験に供するアポE欠損ウサギの繁殖に備え、多検体同時処理が可能でルーチン検査に耐え得る簡便なジェノタイピング法の確立を試みた。標的欠失部位を含むゲノム領域（野生型：79 bp、アポE欠損：66 bp）をPCRにより増幅させ、PCR産物を20% ポリアクリルアミドゲルにより分離する事により、簡便に野生型、ヘテロ欠損、ホモ欠損を判別可能なジェノタイピング法の確立に成功した。
2. アポE欠損ウサギの繁殖
我々の確立した人工授精技術（Liu E et al., 2007）により、アポE欠損ウサギの繁殖を開始した。今後のin vivo実験で用いるホモ欠損個体を効率的に得る目的で雌性ヘテロ個体を優先的に収集している。
3. アポEヘテロ欠損ウサギの糖代謝・インスリン抵抗性に及ぼす影響
アポEヘテロ欠損ウサギを用いて、糖代謝及びインスリン抵抗性に及ぼす影響を検討した。3月齢の野生型及びアポEヘテロ欠損ウサギに20% 果糖/ 10% ココナッツ油を添加した高糖高脂肪食を12週間摂取させた。試験期間中、血漿脂質（総コレステロール、中性脂肪、HDL-コレステロール、遊離脂肪酸）、血漿グルコース及びインシュリンを測定した。また、グルコース及びインシュリン負荷試験を行った。高糖高脂肪食負荷12週後に解剖を行い、蓄積脂肪重量を測定するとともに脂肪細胞サイズの分布及び肝臓中の脂質蓄積を組織学的に解析した。

Current Status of Research Progress

1: Research has progressed more than it was originally planned.

Reason

アポEヘテロ欠損ウサギを用いてin vivo試験を当初の計画より前倒しで実施した。

Strategy for Future Research Activity

アポEホモ欠損ウサギを効率的に得られる繁殖計画を策定し、繁殖を継続する。アポEホモ欠損ウサギを用いたin vivo実験を遂行する。

Research Products

• [Int'l Joint Research] ミシガン大学メディカルセンター(米国)
  • Country Name: U.S.A.
  • Counterpart Institution: ミシガン大学メディカルセンター
• [Journal Article] Principles and Applications of Rabbit Models for Atherosclerosis Research. (2018)
  • Author(s): Fan J, Chen Y, Yan H, Niimi M, Wang Y, Liang J.
  • Journal Title: J Atheroscler Thromb. Volume: 25 Pages: 213-220
  • DOI: 10.5551/jat.RV17018
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Deficiency of Cholesteryl Ester Transfer Protein Protects Against Atherosclerosis in Rabbits. (2017)
  • Author(s): Zhang J, Niimi M, Yang D, Liang J, Xu J, Kimura T, Mathew AV, Guo Y, Fan Y, Zhu T, Song J, Ackermann R, Koike Y, Schwendeman A, Lai L, Pennathur S, Garcia-Barrio M, Fan J, Chen YE.
  • Journal Title: Arterioscler Thromb Vasc Biol. Volume: 37 Pages: 1068-1075
  • DOI: 10.1161/ATVBAHA.117.309114
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Increased Hepatic Expression of Endothelial Lipase Inhibits Cholesterol Diet-Induced Hypercholesterolemia and Atherosclerosis in Transgenic Rabbits. (2017)
  • Author(s): Wang C, Nishijima K, Kitajima S, Niimi M, Yan H, Chen Y, Ning B, Matsuhisa F, Liu E, Zhang J, Chen YE, Fan J.
  • Journal Title: Arterioscler Thromb Vasc Biol. Volume: 37 Pages: 1282-1289
  • DOI: 10.1161/ATVBAHA.117.309139
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Comparative studies of three cholesteryl ester transfer proteins and their interactions with known inhibitors. (2017)
  • Author(s): Wang Z, Niimi M, Ding Q, Liu Z, Wang L, Zhang J, Xu J, Fan J.
  • Journal Title: PLoS One. Volume: 12 Pages: e0180772
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0180772
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Presentation] Macrophage-derived matrix metalloproteinase-1 accelerates aortic aneurysm formation in transgenic rabbits. (2017)
  • Author(s): Niimi M, Nishijima K, Kitajima S, Matsuhisa F, Satoh K, Yamazaki H, Fan J.
  • Organizer: 第49回日本動脈硬化学会総会・学術集会
• [Presentation] Increased hepatic expression of endothelial lipase inhibits cholesterol diet-induced hypercholesterolemia and atherosclerosis in transgenic rabbits. (2017)
  • Author(s): Wang C, Nishijima K, Kitajima S, Niimi M, Yan H, Chen Y, Ning B, Matsuhisa F, Liu E, Zhang J, Chen YE, Fan J.
  • Organizer: 7th International Congress on Rabbit Biotechnology 2017
  • Int'l Joint Research
• [Remarks] 山梨大学大学院総合研究部医学域分子病理学講座
  • URL: https://www.med.yamanashi.ac.jp/clinical_basic/pathol01/