2017 Fiscal Year Research-status Report
Identification of cardiac APCs that activate NKT cells and induce anti-inflammatory function after alpha-GalCer infusion
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17K08791
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| Research Institution | Kitasato University |
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Principal Investigator |
岩渕 和也 北里大学, 医学部, 教授 (20184898)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
佐藤 雅 北里大学, 医学部, 助教 (40611843)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | NKT細胞 / CD1d / 抗原提示細胞 / 実験的自己免疫性心筋炎 / 抗炎症作用 / NKT細胞リガンド / 疾患モデル / マクロファージ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
心臓内でNKT細胞活性化を誘導する抗原提示細胞を探索するため、心組織内のCD1d+細胞を解析した。心組織を細切後コラゲナーゼ消化した単一浮遊細胞中のCD45+細胞のほぼ６割が単球・マクロファージで，このうち平均蛍光強度（MFI）で比較するとF4/80+CD11b+心組織マクロファージ（心Mφ）のCD1dの発現が最も高いことが判明した。低いレベルでは単球にも発現が認められた。心MφはMerTK+CD206+CX3CR1+CD275 (ICOSL)+であった。一方、対照とした脾MφではICOSL-であった。α-GalCer投与１日後の心MφのCD1d MFIと心臓全体で見たIL-10発現は有意に上昇し、投与3日後の心臓iNKT細胞と心Mφは有意に増加した．以上から，心臓内でNKT細胞を活性化する抗原提示細胞の第一の候補は心Mφと考えられた。一方，実験的自己免疫性心筋炎（EAMC）モデルでNKT細胞の活性化が良好な炎症制御をもたらすか否かについては、BALB/cマウスを心筋ミオシン重鎖ペプチドと完全フロイントアジュバントのエマルジョンで免疫して誘導したEAMCを実験治療の対象として検討した。その結果、EAMCを誘導出来た心臓ではHE染色で炎症細胞浸潤、Massonトリクローム染色で繊維化が顕著に認められたが、α-GalCer投与により浸潤炎症細胞数・線維化面積は減少し、この際心組織ではIL-10発現が増加傾向を示し、TNF-α発現は有意に減少していた。以上から、心筋虚血モデルだけでなくEAMCに於いてもiNKT細胞リガンドの投与は有効である可能性が示された。心MφのCD1dを特異的に欠損させた時にリガンド投与による軽快効果が消失するか否かをin vivoで検証する目的で、LysMCre-CD1d1fl/flを交配により作出、心MφでCD1dが発現していないことを確認出来た。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
心臓におけるCD1d発現抗原提示細胞の候補として心マクロファージ（Mφ）を一番の候補と考えられる結果が得られたことは、進捗状況を考える上でプラス要因である。しかし、EAMCマウスモデルの背景系統としてはBALB/cマウスが中心となっている。様々な遺伝子改変マウスが準備されているC57BL/6 (B6)系統でEAMCが誘導来ていないため、今後、LysM-Cre x CD1dfl/flの結果をすぐに有効利用できないというマイナス要因がある。この点をH30年度で解決することが重要なポイントと考えている。一方、そのような中でもBALB/cの系で、CD1d+心MφとNKT細胞（ソート分画）あるいはNKTハイブリドーマを培養してin vitroのNKT細胞応答を確認することができたはずであり、この結果が得られていないことも進捗状況の上で「やや遅れている」として反省している点である。
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| Strategy for Future Research Activity |
心臓における主たるα-GalCer提示CD1d+細胞として心Mφを確定するとともにiNKT細胞の心筋障害軽減効果の基盤について洞察を得る。そのために以下の研究を推進する。
１）in vitroにおける共培養実験：CD1d+心MφとNKT細胞（ソート分画）あるいはNKTハイブリドーマを培養して、活性化マーカー発現、サイトカイン産生を確かめる。心臓の樹状細胞（DC）や他の抗原提示細胞（APC）候補に関しても共培養実験を行うとともに、各種コンディショナルKOマウス（cKO；LysM-Cre, CD11c-Cre, Adipoq-CreとCD1d1fl/flマウスを交配し作製）由来の心Mφ・DC・を用いた培養では活性化をはじめとして、IL-10などの抗炎症性サイトカイン産生が認められないことを確認する。この時、ICOSLその他の表面抗原のIL-10産生への関与について明らかにする。
２）in vivoにおけるCD1d+心Mφを中心としたAPCのiNKT細胞活性化と心筋障害の抑制効果の関連：心筋虚血の系はB6背景のcKOで対照と-GalCer投与でどの細胞にCD1dが発現していることが病態抑制に繋がるかを解析し、１）の結果と比較する。また、BALB/c（WT）やBALB/c背景のNKT-KO（CD1d KO, Traj18 KO; CRISPR-Cas9の系でWataraiらが作製）でNKT細胞のbeneficialな効果をEAMCの系について検証する。
３）細胞移入による実験治療：WTよりも強度の心筋障害を認めるNKT KOの系で外からのiNKT細胞の移入、cKOにおけるa-GalCer負荷CD1d+ APCの移入による治療を試みる。
４）B6における新規抗原誘発性自己免疫性心筋炎モデルを樹立し、B6背景のcKOマウスを病態モデルに使用出来るようにする。
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| Causes of Carryover |
コンディショナルノックアウト（cKO）マウスの育種とBALB/c背景のノックアウトマウスの導入・EAMCモデルの作成が予定より遅れたことが主たる原因である。特にEAMCモデルがペプチド抗原の難容性の問題を解決（現状では解決というよりは改良が妥当）するのに思わぬ時間がかかったこと。したがって、次年度繰越分はcKO育種のためのマウスの購入、BALB/cマウス背景のKO(CD1d KO）の導入、およびペプチド難容性回避のためのホモジェナイザー関連の消耗品購入・ペプチド合成などに支出する予定である。
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[Journal Article] A novel mouse model of iNKT cell-deficiency generated by CRISPR/ Cas9 reveals a pathogenic role of iNKT cells in metabolic disease.2017
Author(s)
Ren Y, Sekine-Kondo E, Shibata R, Kato-Itoh M, Umino A, Yanagida A, Satoh M, Inoue K, Yamaguchi T, Mochida K-i, Nakae S, Van Kaer L, Iwabuchi K, Nakauchi H, Watarai H
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Journal Title
Sci Rep
Volume: 7
Pages: 1-10
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
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[Journal Article] Nerve growth factor regulation and production by macrophages in osteoarthritic synovium.2017
Author(s)
Takano S, Uchida K, Inoue G, Miyagi M, Aikawa J, Iwase D, Iwabuchi K, Matsumoto T, Satoh M, Mukai M, Minatani A, Takaso M.
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Journal Title
Clin Exp Immunol
Volume: 190
Pages: 235-243
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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