2019 Fiscal Year Research-status Report

新規NF-κB抑制因子による炎症性腸疾患における慢性炎症の制御機構

Research Project

Project/Area Number	17K08795
Research Institution	Niigata University of Health and Welfare
Principal Investigator	川村宏樹新潟医療福祉大学, 医療技術学部, 准教授 (20333495)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	樋口雅也金沢医科大学, 医学部, 教授 (50334678) 高橋雅彦新潟大学, 医歯学系, 准教授 (80377192)
Project Period (FY)	2017-04-01 – 2021-03-31
Keywords	マクロファージ / 炎症 / USP10 / サイトカイン
Outline of Annual Research Achievements	【目的】本研究は新規NF-κBの抑制因子のUSP10による炎症性腸疾患における慢性炎症の分子機構を解明して、臨床応用の基盤研究を目的とする。令和元年度（3年目）は、1．細胞内でのUSP10のNF-κBに対する制御機構の解明、2．USP10とNF-κBの関係する炎症反応への影響の検討をおこなった。【結果】1．細胞内でのUSP10のNF-κBに対する制御機構の解明：　USP10とNF-κB の活性に関与る可能性がある因子のＸ因子とＹ因子の検討を行った。Ⅹ因子は非古典経路、Ｙ因子は古典的経路と位置付けられている。J774.1細胞とJ774.1 USP10-KD細胞をLPSで刺激した検討結果から、Ｘ因子とＹ因子は両細胞間で大きな差は認められなかった。以上のことより、774.1細胞に比べJ774.1 USP10-KD細胞をLPSで刺激したTNFαとIL-6の増加は、NF-κBの働きではないことが示唆された。そこで炎症性サイトカイン産生に重要なα因子の関与を検討したところ、α因子が774.1細胞に比べJ774.1 USP10-KD細胞のLPS刺激で低下していた。このα因子は炎症性サイトカインの翻訳に関係していると報告があり、USP10との相互作用が推測された。　2．USP10とNF-κBの関係する炎症反応への影響：　J774.1細胞に比べJ774.1 USP10-KD細胞をLPS/ペプチドグリカン（PGN）刺激でIL-1β産生の増加が認められた。しかしLPS/ATPではIL-1β産生が認められなかった。この理由として、ATPを分解する細胞上の酵素がKD操作や選択培地で活性が低下して、IL-1β産生に繋がらなかったことが推測された。これらよりJ774.1細胞に比べJ774.1 USP10-KD細胞はTNFα、IL-6、IL-1βの炎症性サイトカインが刺激により増加することが確認された。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 本来であれば最終年度の３年目であったが、期間の延長申請をおこなった。その理由として５．研究実績の概要に記述したように、USP10とNF-κBの関係が予想と反して、Ⅹ因子とＹ因子の関与が認められない結果となったためである。しかしながら見方を変えると、これまではＴ細胞のUSP10とNF-κBの関係性の報告であり、マクロファージのTLRシグナルではUSP10の別な制御機構があることが示唆される。また774.1細胞に比べJ774.1 USP10-KD細胞は、炎症性サイトカインの重要な3種のTNFα、IL-6、IL-1βの刺激により増加することが確認されたことは、USP10の炎症反応の制御機能を証明することができた。この炎症性サイトカイン増加にはα因子の関与が示唆されるデータも得ることができた。一方で炎症性腸疾患マウスモデルでの解析を計画していたが、当初の予想と反してUSP10とNF-κBの関係が予想と反した結果となったので解析は一時中断となってしまった。よって研究全体を考えれば、やや遅れぎみであると考える。
Strategy for Future Research Activity	昨年度までの進行状況や結果を踏まえて延長した最終年度は、1．細胞内でのUSP10と炎症性サイトカインの翻訳に関するα因子の相互作用の解明、2．各TLR経路の刺激によるα因子の作用、3．炎症性腸疾患マウスモデルでの解析の3を中心に研究に取り組む。 1．1．細胞内でのUSP10と炎症性サイトカインの翻訳に関するα因子の相互作用の解明：　USP10がα因子に対して直接会合するのか、または何かを介して作用するのか明らかにする。この解析には従来のJ774 USP10-KD細胞に加え、CMVを用いてUSP10-KD細胞にUSP10を戻した細胞や変異細胞、そしてUSP10の多量発現細胞を用いる予定である。 2． USP10とNF-κBの関係する炎症反応への影響：　LPS刺激（TLR4）、Zymosan刺激（TLR2）およびLPS/PGN刺激(TLR4/2)の各TLR経路の場合、α因子が同様にUSP10と作用するのか検討を進める。その後、USP10活性化薬の一つであるレスベラトロールをin vitroの実験系にしようして、炎症抑制作用を検討する。 3．炎症性腸疾患マウスモデルでの解析：　引き続き、in vitroでの実験で得られた結果が、モデルマウス由来のマクロファージでも同様や否かUSP10とα因子を中心とした解析を更に進める。
Causes of Carryover	本報告書の「７．現在までの進捗状況」に記入した通り、USP10とNF-κBの関係が予想と反して、Ⅹ因子とＹ因子の関与が認められないなどが、当初の予定より大幅に進み研究時間の多くの割合を使用した。それに伴い、USP10活性化薬を中心とした炎症反応解析やマウス関連の実験時間が少なくなったので、関連する試薬代などの経費が減少した。最終年度は「８．今後の研究の推進方策」に記載した通り、USP10の炎症抑制作用の解析を中心にマウス関連の解析をおこい今年度は繰り越した経費を使用する予定でいる。