2017 Fiscal Year Research-status Report
COPDマウスモデルの生体肺イメージングによるリンパ球リクルーティング解析
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17K08796
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| Research Institution | Kansai Medical University |
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Principal Investigator |
上岡 裕治 関西医科大学, 医学部, 講師 (50511424)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 生体肺イメージング / 炎症 / COPDモデル |
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| Outline of Annual Research Achievements |
慢性炎症時に新生される三次リンパ組織（TLO）を介して、リンパ球が炎症組織にどのようにリクルートされるのかは未だ明らかにされていない。本研究では、慢性閉塞性肺疾患（COPD）で見られるTLOの一種「iBALT」をマウスモデルで再現し、iBALT内でのHEV類似血管を通るリンパ球のリクルーティングメカニズムを明らかにするため、以下の課題に取り組んでいる。
1. 生理的な条件下（SLO）でのHEVと、慢性炎症によって誘導されるiBALTでのHEV類似血管ではリンパ球の細胞接着、血管外遊走がどのように違うのか？
2. iBALTやその近傍に存在する免疫担当細胞が炎症過程のいつ頃、どのようにリクルートされるのか？また、それらのリクルート過程で細胞接着制御因子Rap1による関与はあるのか？
3. 免疫反応の場としてTLO内のどこで、どのような細胞間相互作用が起こっているのか？
当該年度においては、生理的な条件下でのHEV（膝窩リンパ節HEV）におけるT細胞のrollingおよびarrest現象を二光子励起顕微鏡観察し、Rap1ノックアウトT細胞ではHEVへのリクルーティングが低下することを確認した。またin vitro においてもrollingおよびarrest現象を再現するflow chamber系を構築し、Rap1ノックアウトT細胞ではarrest現象のみが減少することを確認した。Rap1シグナルの詳細を解明するため、Rap1活性化因子（GEF）および不活性化因子（GAP）をT細胞特異的に欠損する遺伝子組換えマウスの作出とそれらの解析を進めている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
糖鎖修飾CD34分子の精製等に時間を要したが、概要で記述した通り、生理的な条件下でのHEVへのT細胞リクルーティングを解析する手法はin vivoおよびin vitroの実験系共にほぼ整い、再現性を確認しながら、データを蓄積して統計処理を行えるレベルまで達している。マウス肺炎症モデルではエラスターゼおよびLPS投与によるCOPDモデルを進めており、BALF（気管支肺胞洗浄液）での確認まで行ったが、イメージングによるTLOの形成確認までは未だできていない。
慢性炎症によってHEV類似血管上にはP/E-selectinが発現し、Effector T細胞等が接着する可能性がある。またICAM-1、VCAM-1、 MadCAM-1といったインテグリンリガンドの発現パターンが時間的、空間的に異なっている可能性があるため、P-selectinやインテグリンリガンド（Fcキメラ分子）のタンパク質精製、抗体の準備をほぼ完了した。今後はin vitro flow chamberモデル、生体イメージング、組織染色、FACS等で各接着因子の発現量、発現パターン、各分子間の相互作用の強さなどを定量的に調べる予定である。
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| Strategy for Future Research Activity |
・エラスターゼおよびリポ多糖投与によるマウスCOPDモデルでTLO (iBALT)が形成されるかを確認する。また生体イメージング等で炎症時での細胞動態を可視化し、細胞接着制御因子Rap1の関与を確認する。
・リンパ球だけでなく、単球、顆粒球、樹状細胞などのミエロイド細胞を用いてCOPDマウスモデルにおけるTLO内の細胞動態イメージングするため、LysM-Cre等の系列特異的Creマウスを用いて、細胞接着制御因子Rap1の関与を調べる。
・FRETバイオセンサーマウス「Eisuke」を用いて、TLOでのリンパ球接着イベントでERK活性に変化があるかを調べる。
・平成29年度中に、HEV類似血管で発現が認められたインテグリンリガンドのプロモーター下に蛍光タンパク質レポーターを導入し、HEV可視化レポーターマウスを作出する予定であったが、実行できなかった。平成30年度も引き続き、本レポーターマウス作出に向けて、準備を進める。
・当初予定していた喫煙によるCOPDモデルは動物実験施設内での安全性等の問題から見送った。代わりに卵白アルブミン（OVA）誘導型喘息モデルの準備を進めている。
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Research Products
(1 results)
