2017 Fiscal Year Research-status Report
バクテロイデス・フラジリス由来の新規カルバペネム耐性遺伝子の網羅的発現と機能解明
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17K08824
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| Research Institution | Gifu University |
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Principal Investigator |
後藤 隆次 岐阜大学, 生命科学総合研究支援センター, 助教 (80326355)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
田中 香お里 岐阜大学, 生命科学総合研究支援センター, 教授 (20242729)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 薬剤耐性機構 / 嫌気性菌 / Bacteroides fragilis / カルバペネム耐性菌 / 全ゲノム解析 / β-lactamase |
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| Outline of Annual Research Achievements |
近年に我々は、腸管常在の嫌気性菌 Bacteroides fragilis のカルバペネム中等度耐性機構の解明を目指し、B. fragilis GAI92214 株の染色体配列をシークエンサー PacBio RS II にて解読し、約 10 kb の未決定領域 1 箇所を除く全配列を決定した。平成 29 年度は、当該未決定領域を解読するために、同染色体をシークエンサー MiSeq で配列決定した（染色体の 49 倍長）。MiSeq データを SPAdes にてアセンブリして得られた 246 本の contig 配列中には、未決定領域に該当する配列は含まれていなかった（解読長の短さと染色体上に散在するリピート配列等が原因と推察）。次に、PacBio データのアセンブリソフト（FALCON）で得たデータ中に不正確領域が含まれている可能性も考慮し、別のアセンブリソフト（HGAP）を用いて再アセンブリを行った結果、従来の配列中に約 11 kb のミスアセンブリ領域が含まれている事が判明した。当該ミスアセンブリ領域を、新たに得た正確な配列で置き換えることにより、未決定領域の閉鎖（修正）を行う事ができた。これにより、一通り、GAI92214 株の環状染色体の全ゲノム配列を決定できた。本菌種の代表的な全ゲノム株（NCTC 9343, YCH46, 638R）に無く GAI92214 株に特異性の高い約 210 kb の領域中には、テトラサイクリンやエリスロマイシン耐性遺伝子の他、class D β-lactamase の遺伝子が含まれていた。本 β-lactamase は GAI92214 株の中等度耐性に寄与する可能性があり、今年度は本酵素の簡易的性状試験にも着手した。来年度以後は、本酵素の詳細な機能解析だけでなく他の耐性因子（薬剤排出ポンプ等）も視野に入れて研究を推進する予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
＜全ゲノム配列決定・構造解析＞ 当初の計画通り、カルバペネム中等度耐性 B. fragilis GAI92214 株の全ゲノム配列を決定し、ORF 抽出、命名を行った。今後に、若干の塩基の修正をする可能性はあるが、現時点での当該株の染色体サイズ、ORF 数、rRNA 数、tRNA 数、prophage 数、CRISPR 数は、順に、5,489,876 bp、4,528 個、18 個、71 個、0 個、2 個である。
＜比較ゲノム解析＞ 計画通り、GAI92214 株と既知の本菌種全ゲノム株 3 株（NCTC 9343 株 [カルバペネム感受性]、YCH46 株、638R 株）の計 4 菌株間で比較ゲノム解析（Link map、べん図作成）を行った。GAI92214 株に特異的な複数の領域中には、不完全な conjugative transposon や不完全な prophage 構成遺伝子等が多くコードされる傾向にあった。
＜薬剤耐性遺伝子の同定・簡易的機能解析＞ 平成 29 年度は、β-lactamase の耐性への寄与を探るべく、全 ORF を β-lactamase database（3,283 個）に対して BLASTP 検索等を行った結果、GAI92214 株の中等度耐性に寄与する可能性のある class D β-lactamase 遺伝子を in silico で同定できた。当該遺伝子をプラスミドベクターに挿入し、多剤感受性大腸菌株へ形質転換後、アンピシリンとメロペネムを用いた薬剤感受性試験を行った。組換え大腸菌は高いアンピシリン分解能を呈したが、メロペネム分解能はコントロールと比べて有意差は無かった。他菌種の類似酵素でも同様の現象傾向が報告されており、今後、シャトルベクターを用いた B. fragilis 菌種内での本酵素の発現・機能解析等を行う予定である。
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| Strategy for Future Research Activity |
（1）B. fragilis 内での class D β-lactamase の薬剤分解活性（カルバペネム系薬を中心）を正確に調べるために、大腸菌-Bacteroides 属間のシャトルベクター内に当該酵素遺伝子を挿入し、得られた組換えプラスミドをカルバペネム感受性 B. fragilis NCTC 9343 株へ形質転換させる。
（2）（1）により当該酵素がカルバペネム耐性に寄与している場合、B. fragilis GAI92214 株（野生株）の染色体にコードされた当該酵素遺伝子を別のシャトルベクターを用いて破壊し、得られた欠損株がカルバペネム感受性になる事を確認する。なお、リアルタイム PCR 等を用いて、当該酵素遺伝子の発現量の解析にも着手する。本年度の進捗に余裕がある場合は、当該酵素の遺伝子組換え酵素を GST 融合タンパクを利用して精製し、その生化学的性状解析にも着手する。
（3）（1）により当該酵素が耐性に寄与していない場合や、寄与が不十分な場合は、染色体上で複数同定された薬剤排出ポンプ等の耐性因子候補の中から、カルバペネム耐性に寄与する可能性のある因子から順に優先して、簡易的機能解析を行う。また薬剤耐性遺伝子検出ソフト（SSTAR 等）を用いて、ポーリン変異等の存在も検索する。
（4）平成 31 年度以降には、RNA-Seq による本格的なトランスクリプトーム解析を行う可能性があるが、それに先立ち、複数の耐性遺伝子候補について、定量 PCR 等で予備試験を行う事も検討する。
（5）上記の Wet な実験と並行して、全ゲノム解析の残るバイオインフォマティクス解析（モチーフ解析に基づく全 ORF の命名の確定、IS やファージ領域のより高精度な同定、染色体内に散在する逆転領域の特定と分類、DNA データベースへの登録など）を行う。
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| Causes of Carryover |
（理由）
染色体中の未決定領域を解読するために使用したシークエンサー MiSeq は、当初、委託解析も検討していたが、学内に同一機器が導入されたため、解析費用を大幅に軽減できた。また菌株間の比較ゲノム解析も委託解析は利用せず、現時点では当研究室内の既存ソフトや無償ソフト等で解析可能であったため、費用を大幅に軽減できた。一方、当初計画外で使用した費用としては、耐性遺伝子の本格的な機能解析（当初、平成 30 年以降に実施予定）を本年度中に開始できたほか、遺伝子命名や発現等、先々にも使用可能な遺伝子解析ソフト（Geneios）を導入したため、物品費の使用が増加した。研究成果報告のための旅費も増額した。以上を相殺して総合すると、約 12 万円の次年度使用額が生じた。
（使用計画）
当研究室のみでは難航する可能性のあるバイオインフォマティクス関連解析（特別なプログラミング言語を要する解析や昨年度未実施であったゲノム情報登録作業等の委託解析）等に未使用額（次年度使用額）も合算して使用する。上記解析が当研究室のみで無償で実施できた場合は、代わりに、GST 融合タンパクを用いた酵素の機能解析に要する物品費等に当該未使用額を使用する。
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