2020 Fiscal Year Research-status Report
バクテロイデス・フラジリス由来の新規カルバペネム耐性遺伝子の網羅的発現と機能解明
Project/Area Number |
17K08824
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Research Institution | Gifu University |
Principal Investigator |
後藤 隆次 岐阜大学, 高等研究院, 助教 (80326355)
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Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
田中 香お里 岐阜大学, 高等研究院, 教授 (20242729)
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Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2022-03-31
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Keywords | 嫌気性菌 / Bacteroides fragilis / 薬剤耐性機構 / カルバペネム耐性 / 全ゲノム解析 / β-lactamase |
Outline of Annual Research Achievements |
これまでに我々は、カルバペネム中等度耐性 Bacteroides fragilis GAI92214 株の全ゲノム配列を決定し、当該耐性に寄与する可能性のある class D β-lactamase を見出した。本酵素遺伝子領域(promoter 保有 ・ 非保有の 2 通り)を E. coli 用ベクター pHSG398 へ導入して得られた E. coli 組換え体は、Ampicillin を分解したが Meropenem を分解しなかった。本酵素を異菌種内で発現させたことが活性に影響を与えた可能性も考えられたため、当該 2 通り遺伝子をシャトルベクター(Bacteroides 属内で複製可能)に挿入し、元菌種である B. fragilis へ導入後、当該酵素活性の測定を試みた。シャトルベクターのクローニング部位にて、lacZ と逆向きに酵素遺伝子を挿入した場合にのみ、promoter 保有・非保有の両方の B. fragilis NCTC 9343 株組換え体が得られた。これら組換え体について、Meropenem、Imipenem、Cefoxitin の MIC 値を測定したが、陰性コントロールと比べて有意差は認められなかった。現在、他の系統を含む複数の薬剤についての詳細な薬剤感受性を調べるとともに、網羅的な遺伝子発現解析を通じた他の耐性因子の寄与を検討すべく研究を進めている。
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Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
Bacteroides fragilis GAI92214 株染色体にコードされた class D β‐lactamase の組換え大腸菌が有意なカルバペネム分解活性を示さなかったことから、元の菌種である B. fragilis へ本酵素遺伝子を導入し機能解析することを試みた。具体的には、大腸菌‐Bacteroides 属間シャトルベクター pNLY1 を改変したベクター(pNLY1Δampr)へ次の 4 通りの断片を挿入した:(1)promoter 保有-class D β-lactamase(lacZ と順向き挿入)(2)promoter 非保有-class D β-lactamase(順向き)(3)promoter 保有-class D β-lactamase(逆向き)(4)promoter 非保有-class D β-lactamase(逆向き)。次に、各組換えプラスミドの B. fragilis NCTC 9343 株への導入を試みた。上記(2)~(4)については、目的の組換え体が得られたため、Meropenem、Imipenem、Cefoxitin の MIC 値を測定したが、陰性コントロールと比べて有意差は認められなかった。上記 (1) については、エレクトロポレーションによる導入実験条件(菌増殖期、培養温度、菌洗浄 Buffer、DNA 量等)を試行したが、目的の組換え体を獲得できなかった。これは、B. fragilis 内で大量発現した酵素の細胞毒性や DNA-タンパク質間結合障害等が生じたためである可能性が高い。本年度は特に上記(1)での導入条件を複数試行することに時間を費やしたために研究成果の進捗にやや遅れが生じた。
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Strategy for Future Research Activity |
(1)当該 class D β-lactamase の基質特異性等の機能解析を拡充するために、得られた組換え体を用いた各種薬剤感受性試験を行う。当該酵素がカルバペネム耐性に寄与している場合、当該遺伝子破壊株を用いた検証試験や、当該組換え酵素の精製・性状解析に着手する。 (2)当該酵素の遺伝子発現解析だけでなく、RNA-Seq による網羅的発現解析を行う。 (3)(2)にて、当該酵素以外にカルバペネム耐性に寄与する因子が推定された場合、これまでに構築したシャトルベクター実験系、薬剤感受性試験実験系等を利用して、同様に機能解析を行う。 (4)2021年度は本研究課題期間の最終年度であり、国内外での成果報告(学会・論文)を更に推進させる。
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Causes of Carryover |
(理由) 当該 class D β-lactamase は、大腸菌内でのアンピシリン分解能を呈したが、カルバペネム系薬分解能を呈さなかったため、元菌種である B. fragilis 内にて、本酵素の機能を解析することを試みた。組換えプラスミド導入のエレクトロポレーション条件の試行に大幅な時間を要し、当初に計画していた各種薬剤感受性試験、遺伝子発現解析、他因子の網羅的検討等の取り組みが遅れた。これら着手できなかった研究に要する消耗品費・受託解析費等を繰り越す必要が生じたため、次年度使用額が生じた。また、国際学会での成果報告がオンライン開催となったため、当初計上していた国外旅費の全額が未使用となり、次年度使用額が生じた。 (使用計画) 研究がやや遅れたことと、次年度使用額が生じたこと等を考慮し、研究効率化のためにも RNA-Seq 等については、外部へ委託解析する予定である。その他、成果報告の効率化に向けて、特にバイオインフォマティクス関連で利用可能な外部委託や共同研究等の推進も検討中である。
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Research Products
(1 results)