2017 Fiscal Year Research-status Report
機能性small RNAの転写後調節機構と相互発現調節機構の解明
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17K08830
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| Research Institution | Okayama University |
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Principal Investigator |
美間 健彦 岡山大学, 医歯薬学総合研究科, 助教 (80596437)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
後藤 和義 岡山大学, 医歯薬学総合研究科, 助教 (20626593)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | Vibrio / small RNA / RNA結合タンパク質 / Csr / 発現調節 / 転写後調節 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
Vibrio alginolyticusのVarS/VarA二成分制御系は、small RNA（Csr）の発現調節を介して制御下の遺伝子の発現を翻訳レベルで調節する。本菌は、VarS/VarA系によって調節されるCsrを４つ（Csr1、Csr2、Csr3、Csr4）持つ。これまでの研究結果から、それらCsrの発現が転写後に調節を受けると示唆された。Csrの転写後調節機構として、Csrのsmall RNA結合タンパク質（CsrA）の結合力の差による可能性が考えられた。そこで、ゲルシフト法を用いて各CsrとCsrAとの結合力を調べた。大腸菌発現系を用いてHis-tag融合タンパク質としてCsrAを生産した。Ni-NTAカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーおよびゲルろ過によりCsrAを精製した。In vitro transcriptionにより各Csrを作製した。得られたCsrAとCsrを用いてゲルシフトアッセイを行った。その結果、いずれのCsrも反応系に添加したCsrAの量に依存して同様のシフトパターンを示した。この結果から４つのCsrは、同等のCsrA結合力を持つと考えられた。したがってCsrの発現量の転写後の調節は、CsrAの結合力の差によるものではないと考えられる。Csrの発現量は、CsrA結合によるCsrの安定化の他に、Csrの分解によっても調節される。他のVibrio属細菌においてCsrの分解は、CsrDが結合することにより促進されることが分かっている。以上より、CsrとCsrDの結合力の差がCsrの発現量を調節している可能性がある。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究課題の目的は、Vibrio alginolyticusのVarS/VarA二成分制御系が調節する４つのsmall RNA（Csr）の転写発現調節機構を明らかにすることである。Csrの転写後発現調節機構の作業仮説として、１）Csrの安定化に関るRNA結合タンパク質（CsrA）の結合力の差による転写後のCsr量の調節、２）Csrの分解に関るCsrDの結合力の差による転写後のCsr量の調節が考えられる。これまでの研究の結果、４つのCsrがCsrAに同様に結合することを明らかにした。これより、Csrの転写後調節機構の作業仮説は、１ではないことが明らかとなった。今後は、作業仮説２について検討する予定である。以上より、４つのCsrの発現量の転写後調機構解明に向けて、着実に進展している。
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| Strategy for Future Research Activity |
４つのCsrの発現量の転写後調節機構について、Csrの分解に関るCsrDの結合力の差による転写後のCsr量の調節機構について検討する。他のVibrio属細菌において報告されているcsrDの塩基配列と相同性解析により、V. alginolyticus I.029株のゲノム配列上のcsrDを同定し、発現プラスミドを構築する。大腸菌発現系を用いてHis-tag融合タンパク質としてCsrDを生産する。Ni-NTAカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーによりCsrDを精製する。精製度が足りない場合には、イオン交換クロマトグラフィーまたはゲルろ過により精製する。In vitro transcriptionにより各Csrを作製する。得られたCsrDとCsrを用いてゲルシフトアッセイを行い、各CsrのCsrDとの結合力の差を比較する。
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| Causes of Carryover |
（理由）
物品の購入にかかる費用が予定よりも安かったため、次年度の使用とした。
（計画）
研究が着実に展開しているため、次年度使用額を有効に利用して研究を展開する予定である。
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