2017 Fiscal Year Research-status Report
マクロファージ由来細胞外小胞を介した結核菌の休眠維持機構の解明
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17K08836
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| Research Institution | Kyoto Prefectural University |
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Principal Investigator |
岡 真優子 京都府立大学, 生命環境科学研究科, 准教授 (40347498)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
堀口 安彦 大阪大学, 微生物病研究所, 教授 (00183939)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | エキソソーム / マクロファージ / 結核菌 / 休眠菌 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
マクロファージ内で生存し増殖する結核菌は休眠状態となり肉芽腫内部で持続潜伏感染できる。このとき休眠期結核菌にわずかな増殖期結核菌が混在していることから、両者の均衡を維持して結核発症を抑制する因子の探索が進められている。近年、異種細胞間の相互作用因子としてエキソソームが着目されるようになり、マクロファージの分泌するエキソソームはヘルパーT細胞を活性化して増殖期結核菌に対する生体防御に働く役割が報告された。しかし、休眠期結核菌とマクロファージ由来エキソソームとの相互作用は不明である。そこで、マクロファージのエキソソームが休眠期結核菌に及ぼす影響を明らかにし、休眠期結核菌の持続潜伏感染の機序解明を目指している。
まず低酸素状態でウシ型結核菌（BCG）を培養後、休眠菌を作成した。抗結核薬（イソニアジド）抵抗性であることから、休眠期にあることを確認した。GFP発現BCG菌をマウスマクロファージ（RAW264.7）細胞に感染させ、菌量を経時的に測定した。増殖期BCG菌は感染24時間後にほとんど排除されたのに対し、休眠期BCG菌はマクロファージ内に存在していた。殺菌因子の活性酸素や一酸化窒素を産生する酵素は転写因子hypoxia-inducible factor-1alpha（HIF-1alpha）によって発現調節されているためHIF-1alphaは、結核菌増殖の抑制因子の1つとして知られている。しかし、両菌の感染するマクロファージでのHIF-1alpha発現量には差がなかったことから、休眠期BCG菌に対する殺菌作用の減弱は、HIF-1alpha以外によると考えられた。次に、両菌感染マクロファージの培養液から各エキソソームを精製した。エキソソームマーカーの発現量は、両者のエキソソームで異なっていたため、エキソソームに内包されているタンパク質の網羅的解析を進めている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成29年度の研究計画内容は、休眠期結核菌をマクロファージに感染後、①休眠期結核菌の量と遺伝子発現、②マクロファージの遺伝子発現解析、また③エキソソームの精製、の3つである。
①休眠期結核菌の量と遺伝子発現：休眠期結核菌量は、増殖期結核菌量よりもマクロファージに多く存在することを確認した。結核菌の遺伝子発現およびタンパク質発現は、マクロファージのそれぞれの発現量が多いため検出感度が低かった。そこで現在、菌量を増やす、また菌をマクロファージから単離する、などの方法を検討している。
②マクロファージの遺伝子解析：増殖期結核菌感染によりHIF-1alpha依存的な遺伝子の発現が増大することを明らかにしている。そこで、休眠期結核菌の感染によるこれら遺伝子の発現量を検討している。解糖系酵素の発現量は、両者により変化がなかった。
③エキソソームの作用：休眠期および増殖期結核菌の感染マクロファージからエキソソームを精製し、エキソソームマーカー量について検討した。今後、ショ糖濃度勾配遠心法により高純度のエキソソームを精製してマクロファージ内結核菌量への影響を評価する。今後休眠期結核菌へのエキソソームの影響を評価するため、低酸素インキュベータ（1% O2、5% CO2）を用いた簡便な休眠菌作製方法に挑戦し、イソニアジド抵抗性およびメトロニダゾール感受性の休眠菌を作製できた。今後、この方法で作成した休眠菌を用いて、96-wellプレートでの菌の増殖評価が可能になると考える。
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| Strategy for Future Research Activity |
肉芽腫に存在する休眠菌と増殖期結核菌の均衡を維持し、結核発症を抑制している機構を解明する。そこで平成29年度より、結核菌感染マクロファージ（ドナー）とマクロファージ内結核菌の解析（実験1）、これらドナーから分泌されたエキソソームのマクロファージ内結核菌への影響（実験2）を検討している。平成30年度は、昨年度の問題を解決し、下記の内容を実施する。
（実験1）マクロファージ内結核菌の遺伝子解析：休眠期および増殖期ウシ型結核菌（BCG）をマクロファージに感染24時間後、増殖期BCG菌がほぼ全て排除されたのに対し、休眠期BCG菌は残存していた。そこで、24時間までに両菌を回収して結核菌の遺伝子解析を行う。このため、結核菌をマクロファージから単離しなければならない。そこで、単離条件を整え、RNA-seq法で解析する。
（実験2）エキソソームの精製およびタンパク質発現解析：休眠期および増殖期BCG菌を感染後、マクロファージからエキソソームを超遠心法で精製した。これを用いて、ショ糖濃度勾配遠心法で高純度のエキソソームを精製する。OptiPrepを用いて12のフラクションに分画し、各フラクションに含まれるエキソソームマーカー発現を検討する。また、休眠期と増殖期のエキソソームでエキソソームマーカーの異なるフラクションを用いて、マクロファージ内BCG菌への影響を評価する。BCG菌はマクロファージにより排除されやすいために評価が困難となる可能性がある。そこで、ヒト型結核菌を用いて同様の実験を進める。
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| Causes of Carryover |
平成29年度、結核菌感染マクロファージ（ドナー）とマクロファージ内結核菌遺伝子発現およびタンパク質の解析を行なう予定であった。しかし、結核菌をマクロファージから分離しなければ検出感度が低く解析できなかったため、平成29年度はその分離方法について検討した。そこで、平成30年度、昨年度の問題を解決し、下記の内容を実施する。
（実験1）マクロファージ内結核菌の遺伝子解析：休眠期および増殖期ウシ型結核菌（BCG）をマクロファージに感染24時間後、増殖期BCG菌がほぼ全て排除されたのに対し、休眠期BCG菌は残存していた。そこで、24時間までに両菌を分離回収して結核菌の遺伝子をRNA-seq法で解析する。
（実験2）エキソソームの精製およびタンパク質発現解析：休眠期および増殖期BCG菌を感染後、マクロファージからエキソソームを超遠心法で精製した。これを用いて、ショ糖濃度勾配遠心法で高純度のエキソソームを精製する。OptiPrepを用いて12のフラクションに分画し、各フラクションに含まれるエキソソームマーカー発現を検討する。さらにエキソソーム中のタンパク質を質量分析法にて網羅的に解析する。
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Research Products
(1 results)
