大腸菌を中心とした腸内細菌のコリバクチン産生機構の解明

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17K08841
• Research Institution: Nippon Veterinary and Life Science University
• Principal Investigator: 吉川 悠子 日本獣医生命科学大学, 獣医学部, 講師 (00580523)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 三好 規之 静岡県立大学, 食品栄養科学部, 准教授 (70438191)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: 大腸菌 / 腸内細菌 / コリバクチン

Outline of Annual Research Achievements

細菌や真菌が保有するポリケタイド合成酵素(PKS)-非リボソームペプチド合成酵素(NRPS)融合タンパク質により産生される二次代謝化合物は生理活性物質の割合が高く、生化学や農業などにおいて重要な天然物を生合成する。コリバクチンは、PKS-NRPS経路をコードする約55kbpの遺伝子クラスターを保有する一部の腸内細菌科の細菌群によって産生され、宿主DNAの二本鎖切断や細胞分裂時に染色体分配異常を引き起こすことから遺伝毒性物質として作用し、大腸発がんに関与すると考えられている。海外における報告を含め、これまでにヒト糞便などから分離された腸内細菌由来のコリバクチン生合成遺伝子群陽性菌のほぼ全てが、系統発生群B2に属する大腸菌である。本研究では、前年度までに外科的に切除した日本人大腸がん患者57名(男性36名、女性21名、年齢:中央値71.0歳)の病理診断の余剰大腸組織から系統発生群B2のコリバクチン生合成遺伝子群陽性菌株を分離・同定した。引き続き本年度は、これらの菌株におけるコリバクチン産生能力の解析を試みた。コリバクチン本体は未だにその構造や動態が明らかとなっていないが、ペリプラズムに移行したプレコリバクチンはclbPによりコリバクチンとN-ミリスチルアスパラギン酸(N-myr-Asn)に分解されることから、コリバクチン生合成遺伝子群陽性菌株のN-myr-Asn産生量を測定した。その結果、 腫瘍組織とその周囲の正常組織由来の分離株のN-myr-Asn産生量に有意な差は見られなかったが、腫瘍組織分離株は産生量が多い群と少ない群に明確に区分された。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本研究は腸内細菌の潜在的な病原性の解析を最終目的としている。前年度までに大腸がん患者の大腸組織由来のコリバクチン生合成遺伝子群陽性菌を多数収集することができた。そこで本年度は、これらの大腸菌のコリバクチン産生能力の解析を重点的に行った。現在のところ、コリバクチン自体を直接観察・検出することが不可能である。コリバクチン生合成経路の最終段階で、菌のペリプラズムまで輸送されたプレコリバクチンは、PKS-NRPS遺伝子クラスターの構成因子の一つであるclbPにより、1分子ずつのコリバクチンとN-myr-Asnに分解される。そこで、N-myr-Asnの産生量を測定することで、間接的にコリバクチン産生量を解析することとした。菌分離・同定時に大腸サンプル一つにつき最大50株までを採取したため、同一の起源を持つ株を選択してしまった可能性が非常に大きかったが、N-myr-Asnの産生量は菌の分離源が同じであっても、株間においてばらつきが見られた。 特に、N-myr-Asnの産生量の多い株が腫瘍組織に多く集積していることから、コリバクチン以外の何らかの菌の因子が腫瘍組織への定着に関与していることが予想された。

Strategy for Future Research Activity

本年度に実施した、大腸がん患者組織由来のコリバクチン生合成遺伝子群陽性菌株のN-myr-Asnの産生量の結果から、腫瘍組織にコリバクチン産生量の多い株が定着していることが判った。この結果は、腫瘍組織近傍の正常組織由来のコリバクチン生合成遺伝子群陽性菌株とは明確に異なる特徴を示していることから、間接的にではあるが、コリバクチン生合成遺伝子群陽性菌株と大腸発がんとの深い関係性が示唆された。次年度以降は理化学研究所バイオリソースセンターに登録されているコリバクチン生合成遺伝子群陽性大腸菌も含めて解析し、大腸がん患者組織で見られたコリバクチン産生菌の腫瘍組織における優占化のメカニズムの解明に焦点をあてる。また、本年度実行できなかった健康な日本人の腸内細菌におけるコリバクチン産生菌の実態を明らかにし、これまでの大腸がん患者の結果との比較を行うことを予定している。 さらに、N-myr-Asnの産生量とコリバクチン生合成遺伝子群の発現を株間で比較することで、より詳細なコリバクチン産生シグナルを解明する。

Causes of Carryover

前年度までに分離したコリバクチン遺伝子陽性菌のコリバクチン生合成時の最終副産物であるN-myr-Asnの産生量の測定を研究連携者の協力により実施することができ、解析経費が想定していたよりも抑えられたことによる。本年度行うことができなかった、健康な日本人の腸内細菌におけるコリバクチン産生菌の実態の解明のため、大腸がん患者と同程度の人数である20名程度のボランティアへの謝金(5,000円/名)としての使用を予定している。物品費として、感染実験に必要な細胞培養用の培地、血清、ピペット、培養フラスコなど、また免疫学的および生化学的解析に必須である宿主側因子の特異抗体、発現ベクターなどに用いる試薬を購入する。また、一般試薬・一般器具類および遺伝子組換え用の特殊試薬の購入にもあてる。旅費は情報収集もしくは学会発表のために利用し、その他は印刷製本または投稿料などの費用である。

Research Products

• [Journal Article] Green soybean extract ameliorates dextran sodium sulfate-induced colitis. (2018)
  • Author(s): Yoshikawa, Y., Murakami, T., Katayanagi, Y., Yasui, K., Ohgo, Y., Imai, S., and Ohashi, N.
  • Journal Title: Natural Product Communications Volume: 13 Pages: 209-212
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Molecular mechanisms of Streptococcus pneumoniae-targeted autophagy via pneumolysin, Golgi-resident Rab41, and Nedd4-1 mediated K63-linked ubiquitination. (2018)
  • Author(s): Ogawa, M., Matsuda, M., Takada, N., Tomokiyo, M., Yamamoto, S., Shizukusihi, S., Yamaji, T., Yoshikawa, Y., Yoshida, M., Tanida, I., Koike, M., Murai, M., Morita, H., Takeyama, H., Ryo, A., Guan, J. L., Yamamoto, M., Inoue, J., Yanagawa, T., Fukuda, M., Kawabe, H., and Ohnishi, M.
  • Journal Title: Cellular Microbiology Volume: 20 Pages: e12846
  • DOI: 10.1111/cmi.12846.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Sequence-based characterization of Listeria monocytogenes strains isolated from domestic retail meat in the Tokyo metropolitan area of Japan. (2018)
  • Author(s): Yoshikawa, Y., Ochiai, Y., Mochizuki, M., Takano, T., Hondo, R., and Ueda, F.
  • Journal Title: Japanese Journal of Infectious Diseases Volume: 71 Pages: 373-377
  • DOI: 10.7883/yoken.JJID.2017.582.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Effects of sanyaku and its constituent diosgenin on the fasted and postprandial hypertriacylglycerolemia in high fat diet-fed KK-Ay mice. (2018)
  • Author(s): Hashidume, T., Sasaki, K., Hirata, J., Kato, M., Yoshikawa, Y., Iwasaki, Y., Arai, H., Miura, S., and Miyoshi, N.
  • Journal Title: Journal of Agricultural and Food Chemistry Volume: 66 Pages: 9968-9975
  • DOI: 10.1021/acs.jafc.8b03040.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Tomato saponin supplementation ameliorates the development of experimental arthritis by regulating inflammatory responses. (2018)
  • Author(s): Yoshikawa,Y., Katayanagi, Y., Kamiya, M., Yamamoto, Y., Fukutomi, R., Imai, S., Miyoshi, N., and Ohashi, N.
  • Journal Title: Journal of Functional Foods Volume: 49 Pages: 458-464
  • DOI: 10.1016/j.jff.2018.09.009
  • Peer Reviewed
• [Presentation] 大腸がん患者から分離された遺伝毒性物質コリバクチン陽性菌の解析 (2018)
  • Author(s): 吉川悠子, 恒松雄太, 松崎信生, 平山裕一郎, 佐藤道大, 三好規之, 岩下雄二, 椙村春彦, 若林敬二, 渡辺賢二
  • Organizer: 第91回日本細菌学会総会
• [Presentation] 高脂肪食を摂取したNASH‐肝発がんモデルマウス糞便中揮発性化合物の分析 (2018)
  • Author(s): 加藤麻衣, 橋詰力, 庄司豊, 庄司（加藤）久美子, 五十嵐美樹, 早川清雄, 吉川悠子, 三好規之
  • Organizer: 第72回日本栄養・食糧学会大会
• [Presentation] 大腸がんリスク因子物質コリバクチンの生産菌検出に関する化学的研究 (2018)
  • Author(s): 平山裕一郎, 松崎信生, 玉舟亮太, 恒松雄太, 佐藤道大, 吉川悠子, 三好規之, 岩下雄二, 椙村春彦,若林敬二, 武藤倫弘, 石川秀樹, 渡辺賢二
  • Organizer: 第25回がん予防学会学術大会
• [Presentation] 鶏肉からのCampylobacter属菌およびListeria属菌の分離状況 (2018)
  • Author(s): 小林清美, 吉川悠子, 高野貴士, 落合由嗣, 望月眞理子, 植田富貴子
  • Organizer: 第161 回日本獣医学会学術集会
• [Presentation] Lipid A biosynthesis in E. coli cultured in metal-depletion (2018)
  • Author(s): Ohashi, S., Hashidume, T., Ishizuka, N., Hayashi, H., Kawarasaki, Y., Watanabe, K, Yoshikawa, Y., Miyoshi, N.
  • Organizer: The 4th International Conference on Pharma-Food
• [Presentation] Assay for proinflammatory activity of structurally modified lipid A. (2018)
  • Author(s): Ohashi, S., Hashidume, T., Ishizuka, N., Hayashi, H., Kawarasaki, Y., Watanabe, K, Yoshikawa, Y., Miyoshi, N.
  • Organizer: 第23回 静岡健康・長寿学術フォーラム