Characterization of antimicrobial peptide produced by Streptococcus intermedius isolate from human brain abscess.

2017 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17K08844
• Research Institution: National Institute of Infectious Diseases
• Principal Investigator: 黒田 誠 国立感染症研究所, 病原体ゲノム解析研究センター, センター長 (80317411)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: Streptococcus / 抗菌ペプチド

Outline of Annual Research Achievements

小児脳膿瘍から分離されたStreptococcus intermedius TYG1620 株の抗菌活性物質Lanthionine 産生系（Interocin）を以下の方法にて生物学的および分子構造学的に解析した。抗菌活性を示す細菌種を薬剤耐性菌（MRSA等）を中心に株単位で詳細に検討し、ブドウ球菌属全般に抗菌活性を示したものの、至適な対象菌とは言い難い結果であった。
そこで、鼻腔に常在するS. intermedius の本来の競合菌種を鼻腔常在菌に有ると仮定し、鼻腔常在菌を血液寒天培地で集団として培養し、その培養菌液とTYG1620 を混合培養することで増殖阻害を示す対象菌種の特定をメタゲノム解析法にて実施した。LactobacillusおよびBifidobacterium属に増殖阻害の効果が見られ、病原細菌であるS. intermedius は常在菌として有用な上記菌種との生存戦略で優位にたとうとしている可能性が示唆された。実験対象は鼻腔常在菌のみであったが、LactobacillusおよびBifidobacterium属への抗菌活性が優位であれば、腸内細菌叢由来の菌種でも検討すべきであると示唆された。
阻害効果を詳細に検討するため、高発現用恒常プロモーターの転写制御下にInterocinオペロン（10 kb）を組込み、大腸菌もしくはBrevibacillusの発現系にて組換え体の増産を試みたが、親株である S. intermedius TYG1620 を勝る抗菌活性は得られずヘテロ発現系の作成は失敗に終わった。TYG1620 株もしくは近縁種における大量コピー数による増産を検討すべきだと思われる。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

抗菌活性を示す対象菌種の特定に近づきつつ有るが、その特異性を精査するための抗菌ペプチド増産および精製法の準備に時間を要した。特に HPLC 等の精製機器類の整備が遅れてしまったことが原因である。次年度(H30）にて、抗菌活性のある標品を単離し、更なる追加解析を実施したい。

Strategy for Future Research Activity

Interocin 高純度品の精製法の最適化および抗菌活性の作用機序解析
・平成２９年度での精製手順の簡略・迅速化を目指し、限外濾過法や逆相クロマトグラフィー等の最適化を試みて、あらゆる精製法の組合せを検討する。MS/MSによる質量分析にて純度の確認とともに正確な分子量を特定する（受託解析）。抗菌活性を示す細菌種を対象に、MIC値の半分量(sub-MIC) を暴露させ、転写量の増減をRNA-seq にて判定し、阻害点と推測される代謝経路を特定する。(これまでの知見上、細胞壁もしくは膜構造の阻害が推測されている)
Interocinの毒性評価
・動物実験の前に各種培養細胞にて乳酸脱水素酵素（LDH）を指標にした毒性評価を行う。細胞毒性が低いことが示唆された場合には、次年度にてマウス動物実験にて毒性評価の追加解析を行う。

Causes of Carryover

(理由)年度末納品等にかかる支払いが平成30年4月1日以降となったため、当該支出分については次年度の実支出額に計上予定。平成29年度分についてはほぼ使用済みである。
(使用計画)上記のとおり。