2018 Fiscal Year Research-status Report

上皮細胞腫瘍化因子レトロウイルスエンベロープの構造と機能の相関性の解明

Research Project

Project/Area Number	17K08848
Research Institution	Hokkaido University
Principal Investigator	前田直良北海道大学, 薬学研究院, 特任准教授 (80444800)
Project Period (FY)	2017-04-01 – 2020-03-31
Keywords	レトロウイルス / JSRV / ENTV / トランスフォーメーション / 腫瘍 / タンパク質 / 構造解析 / 宿主因子
Outline of Annual Research Achievements	本研究では、（１）JSRV/ENTVエンベロープ分子に相互作用し、腫瘍化・トランスフォーメーションに関与する宿主細胞内因子を同定すること、また（２）JSRV/ENTVエンベロープのX線結晶構造解析を行うことを目的として、これまでにJSRVエンベロープ分子のSUドメイン、TMドメイン、およびCT細胞内ドメインをそれぞれGSTとの融合タンパク質として大腸菌で発現させる系を確立してきた。GST-CT細胞内ドメイン融合タンパク質を大腸菌で発現させ、208F細胞溶解液と混合することにより、CT細胞内ドメインと相互作用するタンパク質との複合体をin vitroで形成させ、グルタチオンビーズの添加によって複合体をpull-downし、SDS-PAGEで見られた特異的バンドをMALDI-TOF 型質量分析計により解析した。複数の候補因子の中から今回はビメンチンに着目した。208F細胞からビメンチンmRNAを単離しcDNAを調製後、ビメンチン発現プラスミドを構築した。ビメンチン発現プラスミドとJSRVエンベロープ-HA発現プラスミドを293T細胞にトランスフェクションし、抗HA抗体により免疫沈降を行った。また、JSRVエンベロープ-HAでトランスフォームした208F細胞の溶解液に抗HA抗体を添加することで、同様に免疫沈降を行った結果、両分子の共免疫沈降が観察された。さらに208F細胞を用いたトランスフォーメーションアッセイの際に、ビメンチンに対する阻害剤を添加した結果、JSRVエンベロープによるフォーカス形成に対して濃度依存的な阻害効果が観察された。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason タンパク質発現に成功したJSRVエンベロープ分子のCT細胞内ドメインを用いて同定した相互作用候補分子に、細胞トランスフォーメーションに関与する可能性を見出した。
Strategy for Future Research Activity	タンパク質発現に成功しているJSRVエンベロープ分子のSUドメイン、およびTMドメインを精製し、結晶化のスクリーニングを行う。またX線結晶構造解析は、物質構造科学研究所放射光科学研究施設(高エネルギー加速器研究機構：つくば市)で行う。
Causes of Carryover	物質構造科学研究所放射光科学研究施設でのX線結晶構造解析実験のために必要な試薬類の購入、および旅費に使用する。また、学会発表のための参加費や旅費、およびこれまでの成果を論文発表するための投稿費、校閲費に使用する。