宿主因子ｐｐ３２のインフルエンザウイルス複製促進および感染種適合性の分子機構解明

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17K08850
• Research Institution: University of Tsukuba
• Principal Investigator: 杉山 賢司 筑波大学, 医学医療系, 研究員 (30796454)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: インフルエンザウイルス / 宿主因子 / RNA依存性RNAポリメラーゼ / ウイルス複製

Outline of Annual Research Achievements

平成３０年度では、「宿主因子pp32（以降pp32）のインフルエンザウイルス（以降「ウイルス」）ゲノムRNA複製促進」について、「作用機序（メカニズム）の解析」ならびに「構造学的解析」のアプローチを以下に行った。
これまでの無細胞系ウイルスRNA複製系での解析では、主に酵素源として可溶化ウイルス粒子から調整したウイルス性RNA依存RNAポリメラーゼ（以降「（ウイルス）ポリメラーゼ」）を用い、「pp32が複製中間体（cRNA）から子孫ゲノム（vRNA）への複製第２段階を促進している」ことが明らかとなっていた。そこで新たに、培養細胞発現系で調整したリコンビナントのポリメラーゼを調整しpp32のウイルス複製促進効果の追試を行った結果、複製第２段階のみならず、vRNAからcRNAへの複製第１段階に対しても促進効果が認められた。これは、「ポリメラーゼのRNA複製第２段階特有の開始段階（“priming and realignment”）をpp32が促進しているであろう」というこれまでの考察から、「複製第１/第２段階共通の開始メカニズムを促進している」という考察へと改新する実験事実である。
pp32・ウイルスポリメラーゼの構造学的解析については、化学的修飾法を利用したプロテインフットプリンティング法によって「宿主因子pp32およびウイルスポリメラーゼ」複合体において各因子が結合・接触している領域を解析している。化学的修飾された（及び修飾されなかった）ペプチドの比較を質量分析（MSMS）によって解析していが、現在のところ良質な結果が得られていない。これについては、ポリメラーゼの精製度と化学修飾の効率に改善の必要性があると判明しているので、改良を試みている。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

本研究の鍵となるインフルエンザウイルスポリメラーゼについて、培養細胞発現系による組換え体の調整に難攻した。また、上述の「プロテインフットプリンティング法による「pp32・ ウイルスポリメラーゼ複合体の構造学的解析」において、いささか試行錯誤があり、予定よりも時間が掛かってしまっている現状である。

Strategy for Future Research Activity

最終年度として「研究実績の概要」に記載した一連の研究結果をまとめ、学術雑誌に発表することが目下の方策である。このために、一昨年度（H29年度）で明らかにした「pp32変異体」を利用して得られた結果・考察について、上述の「宿 主因子pp32・インフルエンザウイルスRNAポリメラーゼ」複合体の構造解析（フットプリンティング法）の結果が得られ次第、投稿する予定である。
なお、「現在までの進捗状況」では割愛したが、ウイルスポリメラーゼ組換え体を利用することで「ウイルスゲノムRNA複製の各因子（pp32・ポリメラーゼ・鋳型RNA・基質）の関連性」について詳細に解析したことにより、pp32の複製促進作用機序について重要なヒントとなり得る非常に興味深い結果が得られている。これについても、今年度（H31年度・R元年度）の研究でよりデータを蓄積し、（長期に及ぶことなく本年度内に）相応の学術誌に報告することを目指している。