2018 Fiscal Year Research-status Report
Identification and functional analysis of a cellular receptor for Saffold virus
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17K08865
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| Research Institution | Kanazawa Medical University |
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Principal Investigator |
大桑 孝子 金沢医科大学, 医学部, 助教 (20460347)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | サフォードウイルス / 感染受容体 / UnaG発現組換えサフォードウイルス / cDNAライブラリー |
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| Outline of Annual Research Achievements |
サフォードウイルス (SAFV) は、2007年に初めて分離・同定されたヒトに感染するピコルナウイルス科カルジオウイルス属のウイルスである。世界各地で気道炎、胃腸炎、手足口病様疾患、無菌性髄膜炎、脳炎、膵炎など様々な検体から検出されており、近縁のタイラー脳脊髄炎ウイルス (TMEV、マウスに脳脊髄炎や脱髄を引き起こす) やエンテロウイルスと同様に多様な疾患の原因になると考えられている。
本研究では、SAFV の感染受容体を同定することによって、まだ特定されていない SAFV の標的細胞・臓器を明らかにし、SAFV の病原性と疾患の関連について詳細な解析を行うことを目的としている。
平成30年度は、新たに非感染細胞として CHO-K1 細胞を用いたスクリーニングを開始した。平成29年度に作製した SAFV 高感受性 HeLa 細胞由来 cDNA ライブラリーを100プールに分割し、それらをレトロウイルスベクターを用いて CHO-K1 細胞に発現させた。この CHO-K1 細胞に、感染すると蛍光タンパク質 UnaG を細胞内で発現する SAFV (SAF/UnaG) を感染させ、蛍光顕微鏡下で UnaG 発現細胞 (SAF/UnaG 感染細胞) の多寡を指標として、CHO-K1 細胞を SAFV に対して感受性にした cDNA を含むライブラリープールを選別した。選別したライブラリープールをさらに分割し選出していくことによって感染受容体あるいは感染を促進させる cDNA を同定する。現在このスクリーニングの過程が進行中である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
これまで SAFV 非感染細胞としてスクリーニングに用いてきた BHK-21 細胞は、SAFV に非感受性ではあるが、UnaG 発現 SAFV (SAF/UnaG) の感染によって蛍光タンパク質 UnaG の発現が低頻度ながら見られた。また、スクリーニング過程で、ネガティブコントロールとして HeLa 細胞由来の cDNA を挿入していない空ベクターを用いて調製したレトロウイルスを感染させた BHK-21 細胞において、SAF/UnaG 感染細胞 (UnaG 発現細胞) 数が顕著に増加した。この感染細胞数の増加はマクロピノサイトーシス阻害剤である ethylisopropylamiloride (EIPA) 存在下で抑制されたので、感染性受容体を介した感染ではないと思われる。しかし、SAFV 感受性の有無の判定に支障をきたすことから、新たに非感染細胞の選定を行った。その結果、非感染細胞として CHO-K1 細胞を選定した。CHO-K1 細胞を用いたスクリーニングの条件検討を行い、スクリーニングを再開した。
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| Strategy for Future Research Activity |
CHO-K1 細胞を用いたスクリーニングの条件検討が完了し、スクリーニングを再開することができたので、引き続き感染受容体の探索・同定を行う。また、これと平行して、別の方法として CRISPR/Cas9 法によるゲノムワイドなヒト遺伝子ノックアウトライブラリーを用いた感染受容体の探索を行う。これらの2つの方法による探索の結果、感染受容体およびウイルスの感染・増殖を促進する候補遺伝子群が得られる。さらに、それらの遺伝子について SAFV 感染における機能を解析する予定である。
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| Causes of Carryover |
スクリーニングに用いる非感染細胞の再選定に時間を要し、予定通りに感染受容体の探索を進めることができなかった。そのため、感染受容体の探索の再開に備え、予算を次年度に繰り越した。さらに、これまでとは別の方法として、CRISPR/Cas9 法により作製した SAFV 高感受性細胞のノックアウトライブラリーを用いたスクリーニングを計画している。最終年度は、これまでの方法と新たな方法とで、感染受容体の探索を行い、感染受容体の同定を遂行する。繰り越した予算は、探索の結果得られた候補遺伝子について SAFV 感染における機能を解析するために、実験試薬、培地、器皿類の購入の物品費および研究成果の発表に使用する計画である。
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Research Products
(3 results)
