2018 Fiscal Year Research-status Report
パラミクソウイルスV蛋白質のインフラマソーム抑制能は病原性発現に重要か？
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17K08866
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| Research Institution | Aichi Medical University |
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Principal Investigator |
小松 孝行 愛知医科大学, 医学部, 准教授 (20215388)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
田中 幸枝 福井大学, 学術研究院医学系部門, 助教 (10197486)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | インフラマソーム / パラミクソウイルス / アクセサリー蛋白質 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
NLRP3インフラマソームは，センサー蛋白質NLRP3，アダプター蛋白質ASC，エフェクター蛋白質pro-Caspase-1からなる巨大蛋白質複合体で，Caspase-1を活性化して，抗ウイルス免疫に重要なIL-1βの成熟・分泌を制御する。そのため，ウイルスはこの活性化を抑制することが増殖に有利であると考えられている．我々はこれまでの予備的実験で，パラミクソウイルスのアクセサリー蛋白質Vに，インフラマソーム抑制能が保存されていることを示した（第62，63回ウイルス学会 2014，2015）。そこで本研究では，この抑制能が，① ウイルス感染時に機能しているか？ ② どのようなメカニズムか？ ③ 他のパラミクソウイルスに保存されているか？ ④ 病原性発現に重要か？ を明らかにすることを計画した。
2017年度は，V蛋白質欠損センダイウイルスを用いて，V蛋白質がウイルス感染時に誘導されるIL-1βをインフラマソーム依存性に抑制していることを明らかにした。さらに，過剰発現を用いたインフラマソームの再構成実験によってメカニズムを調べ，V蛋白質がインフラマソームの活性化の開始に必要なNLRP3ホモオリゴマーの形成を阻害することを明らかにした。2018年度は，V蛋白質とインフラマソームの構成分子との結合を調べ，抑制がV蛋白質とNLRP3の結合に相関することを明らかにした。したがって，そのメカニズムは，V蛋白質がNLRP3の立体構造変化，引き続くNLRP3ホモオリゴマーの形成を阻害するため，Caspase-1の活性化に必要なNLRP3/ASC複合体が形成されず，IL-1βの成熟・分泌が負に制御されると考えられた。さらに，他のパラミクソウイルスについても調べ，ニパウイルス，ヒトパラインフルエンザウイルス2型，麻疹ウイルスのV蛋白質が同様の抑制能を有することを明らかにした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
2017～2018年度の二年間で，当初予定していた計画 ①～③（研究実績の概要に既述）をおおむね達成した。得られた成果，① V蛋白質のインフラマソーム抑制能はウイルス感染時に機能している，② そのメカニズムは，V蛋白質とNLRP３の相互作用によるインフラマソームの活性化の阻害，③ 同様の抑制能が他のパラミクソウイルスのV蛋白質にも保存されている について論文投稿を行い (J Virol 92(19): e00842, 2018）パブリッシュした。現在，V蛋白質とNLRP3との相互作用領域を詳細に解析し，相互作用によって何故NLRP3が立体構造変化，ホモオリゴマー形成が出来なくなるのか？ を調べている。さらに，この二年間の成果から，インフラマソーム抑制能は，in vivoの病原性発現に関わる可能性が強く示唆されたので，インフラマソームが活性化されない細胞やマウスにおいて，V蛋白質欠損ウイルスの増殖がどのように変化するか？ を調べる準備を進めている。
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| Strategy for Future Research Activity |
V蛋白質欠損センダイウイルス(SeV V(-))はin vitroでは野生型（SeV wt）と遜色なく増殖できるが，in vivoでは早期に排除される。そのため，V蛋白質はin vivoに特有の自然免疫を制御すると考えられているが明らかではない。そこで2019年度は，V蛋白質によるインフラマソーム抑制能が，この早期排除を説明しうる自然免疫制御能なのか？ 増殖における役割を明らかにする。
以下のように，インフラマソーム依存性IL-1βが誘導されない培養細胞，マウスにSeV V(-)を感染させ，増殖レベルがSeV wt程度に回復するかを検討する。
１）NLRP3，ASC，Caspase-1 などのインフラマソームの構成分子がそれぞれノックアウトされたマクロファージを用いて，SeV V(-)の増殖を調べる。２）IL-1βを処理した細胞での，SeV V(-)の増殖を調べる。３）IL-1β抗体投与したマウスでのSeV V(-)増殖，病原性を調べる。４）マクロファージを著減させたマウスでのSeV V(-)の増殖，病原性を調べる。
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| Causes of Carryover |
2017～2018年度の成果で，V蛋白質のインフラマソーム抑制能は，パラミクソウイルス科のウイルスに保存されていて，in vivoの病原性発現に重要な役割を果たしている可能性が強く示唆された。そこで，最終年度にインフラマソームが活性化されないマクロファージやマウスを用いて，V蛋白質欠損ウイルスの増殖がどのように変化するか？ を調べるという実験を計画したので，それらの材料を購入する費用が生じた。
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