細胞間接触によるウイルス再活性化メカニズムの解明と阻害因子の探索

2017 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17K08869
• Research Institution: National Institute of Infectious Diseases
• Principal Investigator: 菅野 隆行 国立感染症研究所, 感染病理部, 主任研究官 (50272563)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: ウイルス再活性化 / 細胞間接触 / KSHV

Outline of Annual Research Achievements

内臓型カポジ肉腫はエイズ患者の致死的合併症である。カポジ肉腫発症は、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス(Kaposi sarcoma-associated herpesvirus: KSHV)のキャリアにおけるウイルス再活性化と密接な関係がある。我々はKSHVが潜伏感染したB細胞と接着細胞を共培養すると細胞間接触によりウイルス再活性化が起こることを見出した。これはウイルスキャリアの生体内においてリザーバーである潜伏感染B細胞が毛細血管内皮細胞に接触することでウイルス再活性化を起こすモデルを模倣していると考えられる。さらにはウイルス再活性化B細胞から血管内皮細胞への細胞間感染が起こることで腫瘍発生に繋がると考えられ、細胞間接触によるウイルス再活性化の抑制がカポジ肉腫発症予防の鍵であると考えている。
本研究では、KSHV感染B細胞と接着細胞の細胞間接触によるウイルス再活性化メカニズムを明らかにすること、さらにその特異的阻害因子の探索を行い、カポジ肉腫の予防薬開発を目指すことを目的としている。
本年度は、接着細胞培養に困難が生じたが、細胞間接触によるウイルス再活性化の検討に使用する96ウェルプレートを用いた実験系について検出感度、再現性を高めるため使用する細胞の種類、細胞数、細胞間接触時間の最適化を行った。KSHV潜伏感染B細胞として原発性体腔液性リンパ腫(Primary effusion lymphoma: PEL)細胞株であるBCBL-1とBCBL-1由来のEGFP組換えウイルスを保持しているBCBL-1/rKSHV.152細胞を用いて条件を決定することができた。また共培養する接着細胞の検討を行い背景の類似した2種類の細胞で細胞間接触による再活性化誘導能が異なることを見出した。今後この細胞の遺伝子発現プロファイルの比較によりウイルス再活性化の責任遺伝子を絞り込むことが可能となった。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

接着細胞の検討の段階で培養条件等に困難が生じ、実験の進行が大幅に遅れた。だが一方で細胞間接触によるウイルス再活性化誘導能の異なる２種類の細胞を見出すことができた。この2種類の細胞の発現遺伝子比較により候補遺伝子を絞り込むことができ、時間のかかる網羅的なライブラリスクリーニングより小さなスケールで責任因子の探索が可能になったと考えられる。

Strategy for Future Research Activity

細胞間接触による再活性化の異なる2種類の細胞についてDNAマイクロアレイによる遺伝子発現プロファイルの比較検討を行い、再活性化責任因子の候補を絞り込む。その上で、
1) ウイルス再活性化に必要な膜タンパク質の同定　遺伝子導入、遺伝子ノックダウンまたはノックアウト実験で再活性化に必要な膜タンパク質の同定を行う。
2) 細胞間接触によるウイルス再活性化を誘導するシグナル伝達経路の検索　細胞間接触後の経時的な変化をDNAアレイにより検討する。
3) 細胞間接触による再活性化抑制薬剤の探索　1), 2)の結果を統合して化合物、阻害剤ライブラリによる抑制効果のある小分子等の検索を行う。

Causes of Carryover

接着細胞の培養において困難が生じたため実験の進行が遅れ、今年度予定していた実験が翌年度に持ち越された。現在進行中の2種類の接着細胞の比較により標的分子を絞った上で当初予定していた標的分子の遺伝子導入実験、siRNAを用いたノックダウン実験、CRISPR-Cas9 システムを用いたノックアウト実験を行うのでそれらの費用に充当する。