細胞間接触によるウイルス再活性化メカニズムの解明と阻害因子の探索

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17K08869
• Research Institution: National Institute of Infectious Diseases
• Principal Investigator: 菅野 隆行 国立感染症研究所, 感染病理部, 主任研究官 (50272563)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: ウイルス再活性化 / 細胞間接触 / KSHV

Outline of Annual Research Achievements

カポジ肉腫は、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（あるいはヒトヘルペスウイルス８）が原因となる疾患で、日本では高齢者に稀に見つかる 古典型、MSMのエイズ関連型がある。 呼吸器、消化管などに生じる内蔵型は致命的となる可能性があり、ART療法が普及した現在でも治療に難渋する症例が存在する。カポジ肉腫の発症には、ウイルスの再活性化が関与している。カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（あるいはヒトヘルペスウイルス８型）のリザーバーであるウイルス潜伏感染B細胞と血管内皮細胞の相互作用によりウイルス再活性化が誘導され、内皮細胞へのウイルス感染、カポジ肉腫発症に至るとの仮説のもと共培養による実験系を用いてその詳細を明らかにし、発症予防策を見出すべく研究を進めている。
EGFP組み換えカポジ肉腫関連ヘルペスウイルスを保持するPEL(Primary Effusion Lymphoma)細胞株である BCBL-1/rKSHV.152とHeLa細胞株とを共培養しウイルス再活性化マーカーである RTA (Replication and transcription activator)蛋白の誘導を再確認した。さらにHUVECを用いて共培養し同様にRTAが誘導されることを確認した。またこれまで再活性化と関連すると報告のあるシグナル伝達系についてwestern blot による蛋白の発現の検討を進めている。共培養開始後、早期に再活性化を決定づける変化が起こっている可能性を踏まえて共培養開始後 2, 4, 6時間後のサンプルについて検討中である。生体内とより近いと考えられるHUVECを用いて共培養による再活性化に関わる分子について解析を進める予定である。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

再活性化誘導能の異なる細胞で見出された発現量に差のある遺伝子群についての検討では、遺伝子導入効率や発現量の不足など想定通りに検討を進めることができなかった。共培養により得られたサンプルの解析を蛋白発現の検討により進めているが、抗体の特性がそれぞれ異なり陽性コントロールではっきりとしたシグナルが得られないなどの問題が生じている。HUVECの安定した継代培養と共培養の条件について検討が必要であった。

Strategy for Future Research Activity

1) 上皮細胞であるHeLa細胞との共培養による再活性化と同時に、内皮細胞であるHUVECを用いて検討を進める。
2) 共培養を行なった細胞のウイルスドナー細胞、標的細胞を厳密に分ける方法の確立を行う。
3) 共培養を行なった細胞の経時的変化をRNA-seq解析を用いて行う。

Causes of Carryover

これまでの実験結果から、共培養による変化をウイルスドナー細胞、標的細胞それぞれを分離して直接解析することが最も確実な方法であると考えられる。共培養開始後、時間とともにB細胞と標的細胞の接着が起こり確実に2つの細胞を分離できないことが解析の障害となっている。そこで共培養後のウイルスドナー細胞、標的細胞を厳密に分けるための flow cytometry用抗体、それぞれの変化を確実に捉えるためのRNA-seq 解析に必要な費用、生体内により近い環境での解析に必要なHUVEC細胞、専用培地の購入などに使用する。