インスリンによる薬物トランスポーター発現変動機構の解明とその機能変動予測法の確立

2017 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17K08954
• Research Institution: Kyushu University
• Principal Investigator: 廣田 豪 九州大学, 薬学研究院, 准教授 (80423573)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: P糖タンパク質 / インスリン / microRNA

Outline of Annual Research Achievements

P糖タンパク質（P-gp）は、薬物排出型トランスポーターの一つであり、様々な薬物を基質とする。これまでの報告で、ヒトにおいて糖尿病によるP-gp発現変動を介したP-gp基質薬物の体内動態変化が生じる可能性が示唆されている。本研究では、P-gp発現変動の原因物質としてインスリンに着目し、インスリンによるP-gp発現変動機構の解明を試みた。
これまでの我々の研究により、HepG2細胞において、インスリンによりP-gp発現量は有意に減少したが、mRNAの変化は認めなかった。そこで近年、翻訳阻害を介して遺伝子発現制御を行う機能性RNAとして注目されているmicroRNA（miRNA）を対象に解析を進めることとした。miRNAは標的mRNAの3’UTRに作用するため、インスリンによるP-gp発現量減少におけるABCB1-3’UTRの寄与を評価した。ルシフェラーゼアッセイの結果、インスリンによりルシフェラーゼ活性が約25%減少した。よって、インスリンによるP-gpの発現量減少はABCB1-3’UTRを介して起こることが示され、内在的なmiRNAが関与する可能性が示唆された。
miRNAは、Ago2タンパク質とともに標的mRNAに作用することで翻訳抑制機能を持つ。そこで、インスリンによりAgo2結合量が増加するABCB1-3’UTRの領域を特定するために、抗Ago2抗体を用いた免疫沈降を行った。その結果、3’UTRの5’末端から256～382 bpの領域において、インスリンによるAgo2結合の増加が見られた。このことから、同領域に結合するmiRNA がインスリンによるP-gp発現制御に関与すると考えられる。データベース解析により複数のmiRNAがABCB1 3'UTRに作用することが示唆されているため、今後miRNAがインスリンによるP-gp発現制御に及ぼす影響を明らかにする必要がある。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

研究計画のとおり、インスリンがP-gp発現に及ぼす影響についてmiRNAが重要な役割を果たすことを示唆する結果を得ることができた。また、P-gp発現制御に重要なABCB1-3'UTRを特定することができたことから、次年度以降スムーズに機能性miRNAの特定ならびにP-gp発現制御機構の詳細な解析が行うことができると思われる。

Strategy for Future Research Activity

平成２９年度の結果より、インスリンによるP-gp発現制御に関与する候補miRNAを絞り込むことができた。平成３０年度以降は、これら候補miRNAのなかから、インスリンにより発現変動をうけるmiRNAを特定し、当該miRNAがP-gp発現制御機構に及ぼすメカニズムを明らかにする予定である。miRNA特定の後は、当初の予定通りヒトを対象としたmiRNAをバイオマーカーとしたP-gp機能予測臨床試験に進む計画である。

Causes of Carryover

当初の計画と比べて、比較的スムーズにmiRNAがP-gp発現抑制に関与することを明らかにすることができた。このため、平成２９年度は当初の予定より少ない費用で研究を進めることが可能となった。一方、平成３０年度以降は、得られた結果に基づきin vivoにてその機能を評価していく計画であるのでより多額の金額を使用することが想定されるため、次年度使用額は重要な財源となる。