Establishment of novel transgene for in vivo cell tracking by fluorescent imaging

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17K08969
• Research Institution: Institute of Physical and Chemical Research
• Principal Investigator: 田原 強 国立研究開発法人理化学研究所, 生命機能科学研究センター, 研究員 (20419708)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: 蛍光イメージング

Outline of Annual Research Achievements

昨年度に引き続き、新規トランスジーンに対するOff-On型ペプチド蛍光プローブの合成を目指し、候補配列を挙げ、ペプチドの両端に蛍光色素インドシアニングリーン（ICG）を付加し、tobacco etch virus protease（TEVp）のプロテアーゼ活性に依存したシグナルがえられるか検討した。その結果、TEVp遺伝子導入細胞において、経時的および特異的に蛍光シグナルが観察され、このことは、新しい組み合わせのOff-On型蛍光イメージングツールが構築できた可能性を示唆している。
そこで、TEVp導入したヒトグリオーマU87細胞(TEVp-U87)を免疫不全マウスに移植して、今回新たに構築できたOff-On型ペプチド蛍光プローブが、in vitroすなわち培養細胞のみならず、生体内においてもファンクションを有しているのかどうかを検討することを本年度の主たる目的とした。
まず免疫不全マウスの下肢付け根にTEVp-U87細胞を移植し、3週間後にプローブを尾静脈より投与し、1時間後に腫瘍を摘出し、実体蛍光顕微鏡下で腫瘍の蛍光シグナルを観察した。その結果、TEVp-U87細胞において、顕著なシグナルが得られた一方、U87細胞ではシグナルが得られなかった。また、現在、腫瘍の蛍光シグナルが細胞のどの部分由来なのかを調べるために検討中である。このことから、新規Off-On型ペプチド蛍光プローブが生体内においてもイメージングプローブとして有用である可能性が示唆された。現在、動物個体内で、移植した腫瘍由来の蛍光シグナルが得られるかどうかを、生体内蛍光イメージング装置を用いた検討の準備中である。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

最終目的である3次元in vivo蛍光イメージング装置の故障およびメンテナンスに時間がとられたため、実験を進めることができなったため、予想していた進捗状況に比べ遅れている。

Strategy for Future Research Activity

TEVpを発現するがん細胞をマウス皮下に移植し、ある程度成長した時点で、Off-On型蛍光プローブを投与し、がん細胞特異的な蛍光シグナルが得られるか検討し、その結果、顕微鏡下での蛍光シグナルを得ることに成功したため、in vivoイメージング装置（IVISや3次元蛍光イメージング装置)を用いて個体内での観察を行う。
また皮下のみならず、脳腫瘍モデル、がん細胞の尾静脈投与転移モデルなども検討することで、新規イメージングツールの有効性について多くの情報を得る。

Causes of Carryover

機器の故障およびメンテナンスで主たる実験が長期的にストップしたため、研究費の使用量が抑えられたため

繰り越し額および本年度分の予算は、前年度より実施している動物への移植実験、主に動物購入費用として用いる。今後さらに必要となるOff-On型ペプチド蛍光プローブの合成受託費用としても使用する予定である。