2018 Fiscal Year Research-status Report
無細胞系・非放射性・脱超遠心法によるHDLのコレステロール引き抜き能測定法の構築
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17K08975
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| Research Institution | Tokyo Medical and Dental University |
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Principal Investigator |
戸塚 実 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 教授 (60431954)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
大川 龍之介 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 助教 (50420203)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | high-density lipoprotein / apolipoprotein B / 心血管疾患 / リポソーム結合ゲルビーズ / 蛍光標識コレステロール / コレステロール逆転送 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
高比重リポタンパク（HDL）が血管内皮下に蓄積した泡沫細胞から過剰なコレステロールを肝臓に転送する作用（コレステロール逆転送）は、抗粥状動脈硬化の主要な作用と考えられている。その最初のステップであるHDLの細胞からのコレステロール引き抜き能を測定することは、粥状動脈硬化に続く心血管疾患発症リスクの評価に重要であると考えられている。しかし、臨床検査室で実施できる比較的簡易な測定法はなかった。私たちは、培養細胞の代わりに、蛍光標識コレステロールを含むリポソームを固定化したゲルビーズを用いた新たな方法を開発した。しかし、HDLのコレステロール引き抜き能の評価とは言っても、HDLの分離には長時間を要するため、実際に用いた試料は従来の多くの研究と同様、ポリエチレングリコール（PEG）によってアポリポタンパクB含有リポタンパクを除去した血清（apoB除去血清）である。そこで、apoB除去血清がHDLのコレステロール引き抜き能を評価する試料として適当であるか否かの基礎的な検討を実施した。リポタンパクの不均一性を考慮して、PEGの至適濃度の再検討も行ったが、いずれにしてもapoB除去血清はHDLと異なり、血清タンパクのほとんどすべてをそのまま含有している。HDLと比較して膨大な量の血清タンパクがコレステロール引き抜きに関与しないということは考えにくい。実際に、血清タンパクそのものにコレステロール引き抜き能が認められたが、血清タンパク濃度が変化しても引き抜き能に大きな差は見られず、一定のバイアスととらえることができた。むしろ、一定容量のapoB除去血清を用いたコレステロール引き抜き能は、HDLの機能と濃度の両方を統合した総合的機能として評価できる利点があることを明らかにした（Bioscience Reports, 2019, doi: 10.1042/BSR20190213）。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
コレステロール引き抜き能の測定法において、唯一測定法の簡易化の障害になっていたのは培養細胞の使用である。私たちは培養細胞の代わりにリポソーム結合ゲルビーズの利用を考え、その作成に成功した。そして、細胞に代わるコレステロールドナーとしての有用性を１年以内に明らかにすることができた（Bioscience Reports, 2018, doi: 10.1042/BSR20180144）。したがって、次に検討すべき点である測定法の根幹とも言える、ゲルビーズからコレステロールを引き抜くHDL試料の調整法の確立とその妥当性を明らかにする研究に早期に取り組むことができた。従来、超遠心法に代えてPEG沈殿法を用いる方法は研究的に広く用いられているが、基礎的な条件検討は十分とは言えない。私たちはPEG沈殿法でHDLとapoB含有リポタンパクをいずれのコンタミネーションもなく完全に分離することがほとんど不可能であることを確認したが、同時にapoB含有リポタンパクの混入が測定結果に大きく影響しないことを明らかにした。しかし、大きな問題となる可能性があるのはapoB除去血清中の多量の血清タンパクがコレステロール引き抜き能に大きく影響する可能性である。実際に血清タンパクによるコレステロール引き抜き能は認められたが、血清タンパク濃度の異なる検体でもその値に大きな差はなく、apoB除去血清で得られた値をHDLのコレステロール引き抜き能として相対的に比較することが可能であることを明らかにした（Bioscience Reports, 2019, doi: 10.1042/BSR20190213）。したがって、得られた結果を評価するための基準範囲あるいは参照値の確立を目指した研究や心血管疾患既往歴あるいはその危険性のある患者検体の測定もスタートしており、おおむね順調に研究が進展していると考える。
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| Strategy for Future Research Activity |
培養細胞を使用しない画期的なHDLのコレステロール引き抜き能測定法を開発し、培養細胞を用いる従来法と良好な相関が得られることが確認された。また、PEG沈殿法によるapoB除去血清をコレステロールのアクセプターとして使用する方法は、存在する血清タンパクに由来する一定のバイアスが存在するものの、コレステロール引き抜き能が各個人の血清タンパク濃度によって大きく左右されることはなく、相対的に比較可能であることが確認された。むしろ、各個人のコレステロール引き抜き能を総合的に評価できる点で有用性が高いことも明らかにできた。しかし、臨床検査室での実用を考えた場合、得られた結果をどのように利用するのか明らかにすることが重要である。すなわち、一般的な検体検査と同様に基準範囲あるいは参照値を設定し、それと対比して被検者の状態（病態）を推察することが不可欠である。したがって、心血管疾患の既往歴およびそのリスクのない対象から得られた血清を用いてデータを収集し、基準範囲あるいは参照値を確立することが求められる。また、心血管疾患の既往歴があるかそのリスクの高い対象から得られたデータと基準範囲あるいは参照値を比較することによって、開発した方法によるコレステロール引き抜き能検査が従来言われているとおり心血管疾患発症リスクの評価に有用であることを確認し、開発した方法が新たな診断法としての機能を備えていることを明確にする必要がある。また、蛍光標識コレステロールを含むリポソーム結合ゲルビーズの長期安定保存を目指した研究も臨床検査への応用において必須の課題である。加えて、現在HDLによるコレステロール引き抜きのメカニズムは必ずしも詳細に解明されているわけではない。その解明のためにも今回開発した方法を今後の基礎研究にも利用していく予定である。
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