エクソソーム内microRNAを用いた非アルコール性脂肪性肝疾患の予後予測法開発

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17K08984
• Research Institution: Kagawa University
• Principal Investigator: 米山 弘人 香川大学, 医学部, 助教 (80294750)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 正木 勉 香川大学, 医学部, 教授 (30335848)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: 非アルコール性脂肪性肝疾患 / NAFLD / マイクロRNA / エクソソーム / 予後予測

Outline of Annual Research Achievements

非アルコール性脂肪性肝疾患（NAFLD)患者の予後予測に有用なバイオマーカーとしてのエクソソームマイクロRNA(miRNA)を患者血清中に同定する目的でNAFLD患者の保存血清からエクソソームの単離を試みたが研究初年度は収率や純度が不十分でmiRNA解析ができなかった。そこでエクソソーム単離の手順を改良し高品質の血清エクソソームを得ることができ、そこからmiRNAを抽出し、2600種のmiRNAプローブを搭載したオリゴチップにかけて網羅的解析を行った。臨床的プロファイルから軽症NAFLDグループと、肝線維化が進んだ重症グループに分けて上記のエクソソームmiRNAの解析データについてクラスター解析を行ったところ両群間でmiRNA発現パターンに違いを認めた。しかしその中からNAFLD重症度に相関したmiRNAを抽出するためには、重症NAFD患者のサンプル数が少なかったため、新たなサンプル集積とエクソソームmiRNA解析を続け、NAFLDの重症度に関連するmiRNAが複数同定出来た。それらの標的遺伝子の解析も既に行い、患者臨床プロファイルと照合して予後予測に重要と思わるmiRNAの絞り込みを行った。絞り込んだmiRNAをエクソソーム検体においてRT-PCRをもちいて定量し、NAFLD重症度との相関性を検証したところ、昨年度において少数例の解析である程度の相関性を認めていたmiRNAがいずれも単独ではNAFLD重症度と相関しないという結果となった。そこで現在、各miRNAの標的遺伝子をNAFLD進展のメインパスウエイ以外の糖および脂質代謝に関わる蛋白質にまで拡げて検討し、個々の症例のプロテオソームの背景差による影響を排除してNAFLD重症度予測ができるような、複数のエクソソームmiRNAを用いた予後予測式作成に取り組んでいる。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

当初の予定より重症のNAFLD患者の研究登録数が少なく、予後予測のために有用なエクソソームmiRNA抽出のための解析に必要な検体数が不足したため患者リクルートに時間を要した。次年度以降で検体数が増加し候補となるmiRNAを抽出できたが、NAFLD重症度との相関性を検証したところ、いずれも単独では統計的有意性が得られなかった。個々の症例の臨床パラメータ、患者背景や血液データを見直し、各miRNAの標的遺伝子を再検討したところ、NAFLDのメインパスウェイと考えられている標的分子以外の蛋白発現レベルがmiRNAによる重症度予測に干渉している可能性が出てきた。
以上の経緯により、研究目標である血清エクソソームmiRNAによるNAFLD重症化予測式の完成がやや遅れています。

Strategy for Future Research Activity

前述のとおり、血清エクソソームmiRNAによるNAFLD重症化予測に干渉していた要因を解析し、これらの中から重要と推測される項目をピックアップし、これらを補正することで、既に絞り込んでいたmiRNAとNAFLD重症度との相関性を見出すことができるかを検証する。それが成功すれば、補正に用いた臨床パラメータを予測式の中に盛り込むことでエクソソームmiRNAによるNAFLD重症化予測式を完成させる予定である。

Causes of Carryover

前述のとおり、絞り込んだエクソソームmiRNAのみではNAFLD予後予測がうまくいかなかったため、研究登録症例の臨床プロファイルを追加解析する必要があり、その過程で複数の生体物質について保存血清などにおいて測定する予定である。そのために必要な試薬、消耗品費、測定機器など購入のための予算を次年度に繰り越している。また予測式がうまく作成できた場合はその式についてのValidation Studyを新たに登録した症例で検証する予定であり、その際の血清エクソソームmiRNAの解析などにおいて前年度と同様の実験費用が生じると予想され次年度予算として繰り越しています。今年度は以上の研究予定で最終成果を打ち出す予定です。

Research Products

• [Presentation] Assessment of the progression of liver fibrosis by body comparison analysis by bioelectrical impedance analysis (2019)
  • Author(s): Hirohito Yoneyama, Asahiro Morishita, Takako Nomura, Teppei Sakamoto, Koji Fujita, Shima, Mimura, Tomoko Tadokoro, Kyoko Oura, Mai Nakahara, Kei Takuma, Joji Tani, Akihiro Deguchi, Takashi Himoto, Tsutomu Masaki
  • Organizer: The Asian Pacific Association for the Study of the Liver
  • Int'l Joint Research