2018 Fiscal Year Research-status Report
レーザーマイクロダイセクション法による画期的な病原体診断法の開発
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17K08988
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| Research Institution | University of Miyazaki |
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Principal Investigator |
高城 一郎 宮崎大学, 医学部, 准教授 (20418841)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
岡山 昭彦 宮崎大学, 医学部, 教授 (70204047)
越本 知大 宮崎大学, フロンティア科学実験総合センター, 教授 (70295210)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | Laser Microdissection / 細菌同定 / 16S rRNA / 感染症 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、臨床検体のグラム染色標本からLaser Capture Microdissection (LCM)で菌体を回収し、その菌体を遺伝子解析することにより菌種を同定し感染症の診療に役立てることを最終目標としている。2017年度においては大腸菌と黄色ブドウ球菌を用いてLCMを使用した細菌同定法を段階的に検討した。その結果、大腸菌ではアルカリ加熱法で、黄色ブドウ球菌からはAchromopeptidase (ACPase)とInstaGene Matrixを用いた方法を採用して16S rRNA遺伝子の検出を可能とした。また、腹膜炎モデルマウスにおいて10-20個の菌体を貪食した白血球から菌種を同定することが可能であった。2018年度においてはこれらの結果をまとめて、Journal of microbiological methodsに論文として報告した。さらに大腸菌と黄色ブドウ球菌以外の菌種として代表的な嫌気性菌であるバクテロイデス属菌について同様の方法による検出を試みたが、検出が困難であった。これは溶菌操作が困難なためではないかと考えられ、核酸抽出法にさらに工夫が必要であり、本菌を含めたさらに幅広い菌種の検討を計画している。また細菌をそのまま溶菌するよりも細胞に貪食された場合のほうが検出効率が高い傾向がみられたため、そのメカニズムを解明するため、細胞株(THP-1)を用いた貪食実験を行った。その結果、黄色ブドウ球菌を貪食した細胞株では腹膜炎モデルマウスと同様の結果が得られたが、大腸菌は貪食が認められなかった。今後その機序の解明が必要であり、研究を継続している。さらに現在臨床応用を目指し、臨床検体の収集を計画している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究によりLCMを用いてグラム染色標本から大腸菌と黄色ブドウ球菌の16S rRNA遺伝子の増幅および塩基配列の決定する方法を確立し論文として公表した。また、さらに幅広い菌種についても検討が進んでいる。
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| Strategy for Future Research Activity |
2018年度において本方法による検出が成功しなかった嫌気性菌や他の菌種についてDNA抽出法や検出感度の向上を検討する。また臨床検体からの菌種同定について検討を進める。
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