2018 Fiscal Year Research-status Report
| Project/Area Number |
17K09011
|
|---|
| Research Institution | Osaka University |
|---|
Principal Investigator |
高野 徹 大阪大学, 医学系研究科, 講師 (00263236)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
|
| Keywords | FACS / 単一細胞解析 / RNA |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
昨年までの検討で、特にラット正常甲状腺組織から採取した細胞やヒト正常甲状腺組織から採取した細胞では明確な細胞分画の同定が困難であった。そこで組織や細胞株から作成したコントロール検体を使用してFACSにおける免疫染色の最適化について検討することとした。検出する蛋白は従来は甲状腺の胎児性細胞で発現量が変化することが予測されるサイログロブリン、TTF-１、N-Cadherinの３種類であったが、さらに甲状腺の発生初期から発現している特異的蛋白であるNISを追加した。サイログロブリン、TTF-1を発現するFRTL-5細胞株、サイログロブリン、TTF－１、NISを発現するヒト正常甲状腺組織由来の細胞、N-Cadherinを発現する8305C細胞株、TTF－１を発現するPC3細胞をコントロールとして用いた。これら４つの蛋白について、それぞれFluorescein,APC,PE-Cy7, R-PEを割り当て、抗体濃度や染色条件をこれらの細胞が明確に区別できるように最適化し４重測定を確立した。ラット正常組織から採取した細胞、ヒト正常甲状腺組織から採取した細胞について、RNA inhibitorとDTTを加えた緩衝液を適宜使用して４重染色を行い、細胞内RNAを保持した状態でFACSを実施した。ラット正常組織の細胞、およびヒト正常甲状腺組織の細胞のそれぞれで特定の蛋白の発現パターンを示す分画が確認されたため、これらの分画をソーティングし、ISOGEN-LS中に回収して、RNAを抽出後、回収されたRNAのクオリティーをAgilent 2100 Bioanalyzerにて解析した。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
ヒト、ラット組織由来の細胞において、単一細胞レベルに分散することがやや困難であることから、FACSにおいて再現性の高い分画を抽出することが困難な状況が見られた。これを解決するために抗体染色のターゲットの見直しと、染色条件の見直しが必要であった。
|
| Strategy for Future Research Activity |
FACSにおいて特定されたと思われる細胞分画から回収されたそれぞれのRNAについてマイクロアレイを用いた解析を進める。特徴的な遺伝子発現パターンが見られれば、定量的RT-PCRや免疫染色を用いてそれらの細胞分画の特徴づけを行う。
|
