2017 Fiscal Year Research-status Report

非アルコール性脂肪性肝炎進展を抑制するガレクチン9を制御するマイクロRNAの同定

Research Project

Project/Area Number	17K09014
Research Institution	Kagawa University
Principal Investigator	森下朝洋香川大学, 医学部附属病院, その他 (60423430)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	谷丈二香川大学, 医学部, 協力研究員 (00596075) 正木勉香川大学, 医学部, 教授 (30335848) 藤田浩二香川大学, 医学部附属病院, 病院助教 (50749421) 野村貴子香川大学, 医学部附属病院, 助教 (70645415) 米山弘人香川大学, 医学部, 助教 (80294750)
Project Period (FY)	2017-04-01 – 2020-03-31
Keywords	マイクロRNA / ガレクチン9
Outline of Annual Research Achievements	１．WTマウスを用いて、STAMマウスを作製、ガレクチン9投与群、非投与群のそれぞれ肝組織を用いたマイクロRNAの網羅的解析；WTマウスを用い、STAMマウスを作製、４週目より高脂肪食を与えたマウスに週3回90μg/日のガレクチン9を腹腔内投与、9週目(肝線維化出現)と16週目(肝細胞癌出現)に犠死させ、それぞれ肝組織内の脂肪化、炎症、線維化、肝細胞癌の有無、サイズを計測した。投与群、非投与群の肝臓を用いそれぞれマイクロRNAを抽出、ガレクチン9投与群にて著明に増減しているマイクロRNAを同定した。２．ガレクチン9欠損マウスを用いSTAMマウスモデルを作成、NASH進展およびNASH発癌において特異的に増減するマイクロRNAのターゲット遺伝子の実験的確証；ガレクチン9欠損マウスを用いSTAMマウスモデルを作成し、上記１と同様に犠死させ、それぞれ肝組織内の脂肪化、炎症、線維化、肝細胞癌の有無を解析した。また、マイクロRNAを抽出、ガレクチン9の欠損によって特異的に増減しているマイクロRNAを同定した。３. WTとガレクチン9欠損マウスの骨髄由来マクロファージを用いて、脂肪性肝炎下でのガレクチン9欠損による過剰免疫反応に関与するマイクロRNAの解析；WTとガレクチン9欠損マウスの骨髄由来マクロファージを用いて、、脂肪性肝炎時に脂肪細胞から分泌されるレプチン存在下でLPSを培養液に濃度別に投与し、免疫応答の代表的な分子であるCD14とTNFαを測定したところ、ガレクチン9欠損マウス由来のマクロファージではそれらの著明な亢進を認めている。よって、NASH改善効果に大切な役割を果たすM2様マクロファージ (肝ではクッパー細胞)において、ガレクチン9の分泌を制御ことが重要であることを見出し、それに関与するマイクロRNAを同定しつつある。。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason ガレクチン9欠損マウスからのSTAMマウスを作製する際に、生後48時間以内にストレプトゾトシンを注射しなければならず、breedingに少し手間取り、少し作成時間が長めになっている。ただし、STAMマウス自体は順調にNASHの進展、発癌モデルとして十分な役割を果たしているため、それなりに順調であるといえる。
Strategy for Future Research Activity	NASH進展およびNASH発癌において特異的に発現減弱するターゲットマイクロRNAのアデノウイルスベクターを用いた肝特異的レスキューモデルによるin vivoでの機能解析を行う。平成29年度の実験により得られたマイクロRNAプロファイルより、共通する真のターゲットマイクロRNAを解析、同定してゆく。そのマイクロRNAをCMVプロモーターのあるアデノウイルスベクターにサブクローニングし、高力価にしたあとに、STAMマウスの5週目のNASH形成直前に尾静脈より静注し、肝細胞に強発現させる。その後肝組織での脂肪化、炎症、線維化等おNASH進展の度合い、また肝発癌の状態を経時的に解析していく予定である。
Causes of Carryover	分担研究者の他の科研費より、平成29年度の共通の実験に必要な物品の購入があり、重なっていたため、平成30年度以降の予算に移行致しました。またデータの集積や解析に時間がかかり、初年度（平成29年度）に論文や、学会発表は行っておらず、旅費も平成30年度以降に繰り越しております。