2017 Fiscal Year Research-status Report
Comprehensive research of amino acid residues that participate in increasing activity of carbapenemase and structural analysis of mutant enzymes
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17K09018
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| Research Institution | Nara Medical University |
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Principal Investigator |
山本 惠三 奈良県立医科大学, 医学部, 准教授 (90254490)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
矢野 寿一 奈良県立医科大学, 医学部, 教授 (20374944)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | カルバペネマーゼ / 基質特異性 / 構造解析 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
平成２９年度は、既に作成されていたIMP-6を恒常的に発現する大腸菌より、プラスミドpHSG298-IMP-6を単離し、IMP-6遺伝子に対して1Kbあたり１塩基置換程度の頻度で変異が導入される条件で、変異導入PCRを行った。得られたフラグメントをpHSG298-IMP-6の野生型IMP-6遺伝子と入れ替えて挿入し、変異型IMP-6遺伝子を持つプラスミドライブラリーを作成した。
得られたプラスミドライブラリーを用いて大腸菌DH5αを形質転換した。得られた形質転換体297コロニーを合わせて、0.016mg/mLのメロペネムを含むLB培地で培養後、生育した菌体を個々に分離し、遺伝子配列を決定した結果、Tyr123→Asn（Y123N）のアミノ酸置換を有する変異型酵素をコードするIMP-6遺伝子を同定した。
次に、精製酵素を用いてY123Nの酵素学的性質の決定を行った。イミペネムに対するkcat/Kmが0.25 mM-1s-1であるのに対し、メロペネムに対するkcat/Kmは、10.0 mM-1s-1であり、40倍の差が見られた。元のIMP-6ではこの差は７倍であったため、メロペネムに対する活性が大幅に増加するアミノ酸置換であることが分かった。
既に構造が決定されているIMP-1の構造を元に、Tyr123の役割について考察した。Tyr123はβ７とβ８に挟まれたループのＣ末端側に位置し、このループのＮ末端側にあるPhe118の側鎖とπ電子－π電子相互作用をしていることが分かった。このループは、IMP型カルバペネマーゼのＮ末ドメインとＣ末ドメインを結んでおり、この相互作用により安定化していることが示唆された。また、この２つのアミノ酸はすべてのIMP型カルバペネマーゼに保存されていることから、基質特異性の維持に重要な役割を果たしていることが考えられた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
当初の計画では、平成２９年度においてはPCRによる変異導入→メロペネム存在下における培養による選択という人工進化実験を繰り返し、メロペネムに対する活性が上昇するアミノ酸置換の位置や種類を網羅的に同定する予定であった。ところが、１回目の人工進化実験で非常に興味深いTyr123→Asnという変異型IMP-6を得たため、この酵素の解析に時間がかかったことから、実験全体の進捗が少し遅れてしまった。
また、当初使用を予定していたプラスミドpHSG298-IMP-6をもつ大腸菌が産生するIMP-6タンパク質量が少なかったため、薬剤感受性試験がうまくいかなかったこと、及びPCRによる変異導入効率が十分でなく、条件設定のやり直しを行っていたことが進捗が遅れた理由として挙げられる。しかしながら平成２９年度において、前者においては、恒常的な発現量がより高いプラスミドpHSG398を用いることによって、薬剤感受性試験が良好に行えるように改善を行った。後者については、pHSG398に挿入したIMP-6遺伝子に対してPCRによる変異導入の条件を再決定することで解決した。
これらの改善に時間がかかったため、当該年度の進捗は少し遅れることとなったものの、より安定にPCRによる変異導入→メロペネム存在下における培養による選択のサイクルをを行えるようになった。既に、新規に作成したpHSG398-IMP-6を用いて人工進化実験を行っており、野生型IMP-6を産生する大腸菌より高濃度のメロペネムを含む培地で生育する大腸菌株を複数得ている。従って、平成３０年度以降は当初の計画に沿った実験が可能であると考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成２９年度に新たに作成した、pHSG398-IMP-6を用いた人工進化実験を継続する。PCRで変異を導入して得られた250個以上の形質転換体について、野生型IMP-6を産生する大腸菌より高濃度のメロペネムを含む培地で生育するかどうかを検討し、陽性の形質転換体よりプラスミドを調製してDNA配列を決定する。さらに、プラスミドライブラリー全体に対して、変異を導入して、２回目以降の人工進化実験を行う。決定されたアミノ酸配列を元に、そのアミノ酸置換が立体構造上、どのような位置にあるかを調べ、構造に変化をもたらしそうな変異を持つ酵素については、それを産生する大腸菌の薬剤感受性を詳細に調べるとともに、精製酵素を作成して、酵素学的性質について検討を行う。これらのデータをもとに、部位特異的変異を導入することにより、アミノ酸置換が性質に及ぼす加算性の有無や、１つの置換位置に対して異なるアミノ酸を導入した場合の影響についても検討を行う予定である。
構造学的解析については、平成２９年度において、野生型IMP-6の結晶化条件の再検討を行った。その結果、安定に結晶が生じる条件がかなり絞れてきているので、良好な外形を持つ結晶について、実験室レベルのＸ線発生装置を用いた予備実験を行う。その結果をもとに、SPring-8において、高分解能の回折データを収集する予定である。構造解析については当初の計画通り、すでに得られている低分解能のIMP-6の構造を用いた分子置換法により行う予定である。また、平成２９年度において、興味深い性質を示したY123N変異型酵素についても、結晶化条件のスクリーニングを行い、野生型酵素と合わせて解析を予定している。このほかにも、今後得られる予定の変異型酵素について、並行して結晶化条件の検索を行っていく。
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| Causes of Carryover |
平成２９年度の実験において、早期にメロペネムに対して野生型より耐性を有する変異型酵素（Tyr123→Asn）を産生する大腸菌を見出すことに成功した。ところが、Y123Nの酵素学的性質の決定、及びそれを産生する大腸菌の薬剤感受性試験に日数がかかったため、PCRによる変異導入→メロペネム存在下における培養による選択という人工進化実験のサイクルをほとんど回せなかった。このため、人工進化実験の結果の解析に必要な、DNA配列決定と薬剤感受性試験の実施に必要な経費を予定通り使用できなかったため、次年度使用額が生じた。
これに関しては、平成２９年度中に実験系の改良を行い、人工進化実験のサイクルを予定通り行うことができるようになった。従って、DNA配列決定と薬剤感受性試験を多検体にわたって行う必要があるため、繰り越した予算の使用が必要と考えている。また、平成３０年度には、Ｘ線結晶構造解析を予定しており、結晶化スクリーニングの実験を行う予定である。これに必要なスクリーニングキットの購入を予定している。以上のことから、平成３０年度については、予定通りの予算執行が可能と考えている。
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Research Products
(9 results)
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[Journal Article] Suitability of the Carbapenem Inactivation Method (CIM) to Detect IMP Metallo-β-lactamase-Producing Enterobacteriaceae.2017
Author(s)
Saito K, Nakano R, Suzuki Y, Nakano A, Ogawa Y, Yonekawa S, Endo S, Mizuno F, Kasahara K, Mikasa K, Kaku M, Yano H
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Journal Title
J Clin Microbiol
Volume: 55
Pages: 1220-1222
DOI
Peer Reviewed
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[Presentation] Accuracy of carbapenem inactivation method (CIM) for detecting carbapenemase-producing Gram-negative bacteria corresponding to bacterial species and enzymes.2017
Author(s)
Saito K, Nakano R, Suzuki Y, Nakano A, Yonekawa S, Endo S, Mizuno F, Kasahara K, Mikasa K, Kaku M, Yano H
Organizer
27th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases
Int'l Joint Research
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