2017 Fiscal Year Research-status Report
Inter-GPCR interplay regulate intractable itch.
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17K09040
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| Research Institution | Juntendo University |
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Principal Investigator |
上窪 裕二 順天堂大学, 医学部, 助教 (80509670)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
冨永 光俊 順天堂大学, 医学(系)研究科(研究院), 先任准教授 (50468592)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | Gタンパク質共役型受容体 / 代謝型グルタミン酸受容体 / ライブセルイメージング / 蛍光蛋白質再構成 / FRET |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本計画は、Gタンパク質共役型受容体(GPCR)同士の相互作用による痛みとかゆみとクロストークの生理的・分子的機構の解明とかゆみの神経伝達の制御を目指すものである。痛みとかゆみの神経伝達系のおけるGPCR相互作用について解明を行うために以下を実施を目指した。(1) GPCR複合体の時空間ダイナミクスの解析。(2)ターゲットGPCRの安定発現細胞株の作製とシグナル伝達解析法の確立。(3)cDNAディスプレイ法を用いた抗GPCR人工抗体の作製。
GFPなどの蛍光タンパク質融合のGPCRを発現させた場合では発現したGPCRのすべてが蛍光を発するため、細胞膜上での相互作用が評価できない。そこで、GPCRのポストラベル法を確立しライブセルイメージングによる細胞膜表面上におけるGPCRの挙動の解析を行った。今後はフェルスター共鳴エネルギー転移（Forster resonance energy transfer, FRET）法や全反射照明蛍光顕微鏡 (TIRF)法による解析を進める予定である。さらに蛍光蛋白質再構成 (bimolecular fluorescence complementation, BiFC)法によるGPCR複合体解析を行った。作製したGPCR安定発現細胞株と初代培養神経細胞を標本としてGPCRの細胞内シグナルの定量化を行った。その結果、これまで未解明であったGPCRのシグナルクロストークが明らかとなった。cDNAディスプレイ法による人工抗体の作製は条件検討がほぼ完了し、ターゲットGPCRに対する抗体の作製を行う予定である。一方で人工抗体ができなかった場合に備え、大量合成したGPCRを抗原とした特異的抗体の作製も並行して進めている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
現在までの研究計画では、ターゲットGPCRの相互作用部位の決定と機能的役割の解析を目指し研究を行ってきた。研究課題の計画どおり、GPCR同士の複合体形成の解析法の確立し、安定発現細胞株におけるGPCR相について生化学的解析を行った。その結果、ターゲットGPCRの相互作用は多モードである可能性が示唆され、さらなる研究が必要であることが明らかとなった。また、GPCRのポストラベルとライブセルイメージングを駆使し、ターゲットとするGPCRの相互作用とその時空間ダイナミクスを明らかにしてきた。さらに時間分解FRETやホタルの発光酵素（ルシフェラーゼ）を応用した細胞内シグナル伝達の解析を行い、ターゲットGPCRの機能的相互作用の解明を進めている。また、げっ歯類脊髄の組織培養と分散培養の実験系を確立しており、当初の計画以上に進展していると考えられる。
一方、cDNAディスプレイ法とラクダ由来シングルドメイン抗体の組合せによる人工抗体の作製を実用化するにはさらなる条件検討が必要であるためやや遅れが生じている。一方で、GPCRの無細胞大量合成法を導入し、大量合成したGPCRを抗原とした抗体の作製を検討しており、人工抗体の作製が遅れても計画の進行に支障がないように進めている。
掻痒モデルの作製については、研究分担者と共同で進めており、おおむね順調に進んでいる。一方でその分子メカニズムの解明は特異的抗体の作製後になる予定である。
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| Strategy for Future Research Activity |
cDNAディスプレイ法とラクダ由来シングルドメイン抗体の組合せによる人工抗体の作製法の確立は進んでいるが、ターゲットGPCRに対する抗体の作製は遅れている。そこで、共同研究者らと協力しDNAアプタマーや無細胞大量合成GPCRを抗原とした抗体の作製を進めている。FRET法やTIRF法などのライブセルイメージングとポストラベル法を組み合わせることで異種GPCR同士の複合体形成とその時空間ダイナミクスの解析を詳細に解析する予定である。一方、順調に進んでいる掻痒モデルを使ったかゆみ行動の解析をすすめ、GPCR相互作用をターゲットとしてかゆみの制御を目指す予定である。
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| Causes of Carryover |
抗GPCR人工抗体の作製が遅れているため。
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