2018 Fiscal Year Research-status Report
Inter-GPCR interplay regulate intractable itch.
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17K09040
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| Research Institution | Juntendo University |
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Principal Investigator |
上窪 裕二 順天堂大学, 医学部, 助教 (80509670)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
冨永 光俊 順天堂大学, 医学(系)研究科(研究院), 先任准教授 (50468592)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | Gタンパク質共役型受容体 / シナプス / ライブセル・イメージング / 掻痒 / 疼痛 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
神経系には多様なGタンパク質共役型受容体(GPCR)が発現しており、神経細胞の分化、回路形成、シナプス伝達、およびシナプス可塑性など様々な役割を果たしている。近年、異種または同種のGPCR同士が二量体や多量体を形成し、相互作用し合うことで単量体では実現できないような高度な機能制御を行っているという報告がなされている。本計画は、GPCR同士の相互作用による感覚伝達クロストークの生理的・分子的機構の解明とかゆみの神経伝達の制御を目指すものである。痛みとかゆみの神経伝達に関与すると考えられるGPCR同士の相互作用について解明を行うために以下を実施した。
(1) ライブセル・イメージングによるGPCR複合体の時空間ダイナミクスの解析。(2)ターゲットGPCRの誘導発現細胞株を用いたシグナル伝達解析。(3)GPCR相互作用のための人工抗体の作製。
一過性遺伝子導入によるGPCRの過剰発現系では、GPCRの挙動が変化する可能性が示唆された。そのため低発現量のドキシサイクリン誘導性GPCR安定発現細胞株を作製し、機能的相互作用、局在、および複合体形成について検討を行った。その結果、シナプス伝達の調節にかかわるGPCR複合体形成、細胞膜近傍での共局在、およびシグナル伝達の相互作用が明らかとなった。さらに、これらのGPCRは四量体以上の大きな複合体を形成している可能性が示唆された。複数のGPCRからなる複合体を解析するため、発光イメージングなどの新しい解析方法の導入を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
これまで研究代表者らは、神経伝達にかかわるGPCR同士の相互作用についての解析方法の確立を進めてきた。その結果、フェルスター共鳴エネルギー転移(FRET)法、全反射照明蛍光(TIRF)顕微鏡法、および蛍光タンパク質再構成(BiFC)法などによるGPCR複合体の解析方法を確立してきた。確立した手法を用いて新たに明らかにしたGPCR複合体の解析をさらに進めた結果、四量体以上の大きなGPCR複合体形成の可能性が示唆された。そのため複合体の時空間ダイナミクスは二量体の場合に比べ複雑となることが予想される。そこで、翻訳後標識(ポストラベル)法やスプリットルシフェラーゼを用いた発光イメージング法取り入れた解析方法の確立を目指し研究を進めている。上記のように細胞レベルでのGPCR複合体解析については当初の計画以上に進展していると考えられる。また、初代培養神経細胞をもちいたGPCRの複合体形成と機能的相互作用を行った。初代培養では神経細胞以外の細胞もある一定割合で混入するため、ホモジニアスアッセイでは評価が難しいことが明らかになった。一方、GPCR相互作用の解析のための人工抗体作製については、昨年度に引き続き進めているが、実用化までにはさらなる検討が必要である。そのため、標的GPCRにアフィニティータグを導入し、アフィニティータグを認識する人工抗体を作製することで、GPCR相互作用の解析を進めている。
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| Strategy for Future Research Activity |
研究代表者らが明らかにしたGPCR複合体は四量体以上である可能性が高い。そのため、従来の相互作用解析方法ではその本質を捉えきれない可能性が高い。そのため、ポストラベル法や発光イメージングなどの方法を新たに導入し。これまでに実現してきたGPCRのイメージング解析方法と組み合わせることで、巨大なGPCR複合体の解析を目指す。
神経細胞におけるGPCRの機能的な相互作用については、マルチウェルプレートレベルでの解析では評価が難しいため、Fura2などのカルシウム感受性色素を用いたカルシウムイメージングやPink FlamindoなどのcAMP 可視化蛍光タンパク質センサーを用いたcAMPイメージングなどを実施し、一細胞ごとにシグナル伝達変化を評価する。
GPCRを認識する人工抗体の作製については条件検討が進んでいるため、実用化に向けて引き続き進めていく。GPCR相互作用の解析を効率よく進めるために、アフィニティータグを認識する人工抗体を用いてGPCR複合体形成の解析とその操作方法の確立を目指す。遺伝子導入を行い、アフィニティータグ付きGPCRを発現させて解析を行う必要があるため、細胞株や、初代培養神経細胞をもちいて解析を進める予定である。
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| Causes of Carryover |
研究計画の進捗により従来予定していた実験を実施しなかったため、次年度使用額が生じた。次年度では、これまでに見出したGPCR相互作用の解析を行う予定である。そこで、神経細胞におけるGPCRの機能的相互作用を検討するための初代培養、モデル動物作製のために使用する。
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