2020 Fiscal Year Annual Research Report

Analysis of exosomes released by exposure to metal oxide nanoparticles and their effects

Research Project

Project/Area Number	17K09165
Research Institution	Jikei University School of Medicine
Principal Investigator	与五沢真吾東京慈恵会医科大学, 医学部, 講師 (70381936)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	柳澤裕之東京慈恵会医科大学, 医学部, 教授 (10200536)
Project Period (FY)	2017-04-01 – 2021-03-31
Keywords	金属酸化物 / ナノ粒子
Outline of Annual Research Achievements	酸化亜鉛ナノ粒子(Zinc oxide nano-particles, ZnONPs)は、化粧品などUVカットニーズを背景に需要が拡大している。凝集して100～200nmの二次粒子径を呈し、肌へ塗布しても安全であると考えられているが、酸化ストレスや変異原性等、毒性も報告されている。また近年、細胞がストレスに晒されて放出する細胞外分泌小胞（Extracellular vesicles, EV）が注目されており、ZnONPs曝露細胞が独特な細胞外分泌小胞を放出している可能性も考えられる。そこで、ZnONPsのヒト角化細胞HaCaTに対する曝露影響について、曝露細胞が放出するEVの解析を通して検討した。 HaCaTにZnONPs（ZnO-650 (住友大阪セメント)）を曝露させ、細胞増殖抑制効果を検討した。subtoxicな濃度で曝露した細胞から超遠心法でEVを回収・精製した。DLS法による粒径を測定すると、ZnONPs曝露時のEV粒径は非曝露時と比較し小さくなっていた。SDS-PAGEによりタンパク組成解析を行うと、分子量80-90kD付近にZnONPs曝露特異的なバンドが観察された。そのバンドをピッキングしLC-MS/MSで同定したところ、CK1等の分化型ケラチンがヒットし、分化誘導の可能性が示唆された。そこで分化マーカーのインボルクリン(INV)の発現を調べると、蛍光抗体法による細胞染色でも全細胞抽出液のイムノブロットでもZnOPsによる増加がみとめられた。このときAktのリン酸化増強も観察された。リン酸化をPI3K-Akt経路の特異的阻害剤で阻害するとINVの発現陽性細胞割合は減少した。またSA-βGal陽性細胞の割合が増加した。以上より、ZnONPsがPI3K/Akt経路依存的にHaCaTに分化誘導や細胞老化を促すと考えられた。