2018 Fiscal Year Research-status Report
低忠実性ポリメラーゼ導入ウイルスによるインフルエンザ未来流行株予測システムの開発
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17K09170
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| Research Institution | Kawasaki Medical School |
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Principal Investigator |
内藤 忠相 川崎医科大学, 医学部, 助教 (50455937)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | インフルエンザウイルス / ワクチン開発 / 抗原変異 / ウイルスポリメラーゼ / 遺伝子変異 / 免疫逃避 / ウイルスライブラリー |
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| Outline of Annual Research Achievements |
インフルエンザウイルスのゲノムは8本に分節化された1本鎖RNAであり、ウイルス由来ポリメラーゼであるPB1蛋白質（Polymerase Basic Protein 1）によって複製されるが、新規合成されたRNAゲノム内には1万塩基あたり約1個の頻度で変異が生じる。この高い変異導入効率により、季節性インフルエンザウイルスでは頻繁に抗原変異が起こり、流行予測から選定されたワクチン株と実際の市中流行株との間で抗原性が一致せず、ワクチンによる重症化阻止効果が著しく低下する事態が生じる。
本研究では、国内外において申請者が初めて単離した「インフルエンザウイルス野生株よりさらに変異が入りやすい低忠実性ポリメラーゼ導入ウイルス（PB1-Y82C株：PB1の82番目のTyr残基をCys残基に置換した変異株）」を用いて、次シーズン以降の流行株に起きる抗原変異部位を予め推測できる「インフルエンザウイルス未来流行株予測システム」を開発する。そして、新規抗原変異株（抗原ドリフト型変異株）の性状解析を行うことで、流行株と抗原性が一致するワクチン株を選定できる基盤情報を蓄積する。
（１）インフルエンザウイルス実験室株A/Puerto Rico/8/1934株（PR8株）のPB1を低忠実化に改変し、変異ウイルスライブラリー作出用の母体ウイルスを構築した（PR8-PB1-Y82C）。
（２）近年にヒトから分離されたA(H1N1)pdm09株の主要抗原であるウイルス遺伝子（ヘマグルチニン抗原およびノイラミニダーゼ抗原）をPR8-PB1-Y82Cに組込み、培養細胞を用いて組換えウイルスを増殖させることで変異ウイルスライブラリーを作出した。
（３）モルモットにA(H1N1)pdm09野生株を免疫して作製した抗ウイルス抗体を変異ウイルスライブラリーと反応させることで、中和反応から逃避した抗原変異候補株を複数単離した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
インフルエンザウイルスゲノム複製過程において、PB1ポリメラーゼ蛋白質のTyr82残基が変異導入効率を制御する機能部位であることを明らかにした（論文投稿中）。近年の市中流行株であるA(H1N1)pdm09ウイルスを元株として、ヘマグルチニンとノイラミニダーゼの抗原変異を誘導する免疫逃避候補ウイルスの単離に成功し、抗原変異候補株のゲノムシーケンス解析の結果、A(H1N1)pdm09株のヘマグルチニンおよびノイラミニダーゼのゲノムにこれまで報告例がない塩基変異を見出した。さらに、免疫選択圧をかけない条件下の変異ウイルスライブラリーから複数個のウイルスを単離しゲノムシーケンス解析を行った結果、同一粒子内の2種類のゲノムに、これまで報告例のない機能未同定のアミノ酸変異が“同時”に導入されていた。この結果は、インフルエンザウイルスポリメラーゼを人為的に低忠実化に誘導することで、培養細胞を用いたウイルス継代によって、高頻度で遺伝子変異が生じていることを示している。このように本システムは、従来の変異株スクリーニング系では単離が不可能であった“多分節ゲノム間の多塩基変異（エピスタシス効果）”に由来する新型インフルエンザウイルスの出現を予測できる可能性があり、将来に流行する新型ウイルスを効率的にスクリーニング可能な実験系であることが示唆された。引き続き研究を遂行することにより、当初の目的を達成できると考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
免疫逃避ウイルスのゲノムシーケンス解析による新型インフルエンザウイルス株の単離：すべての免疫逃避ウイルスについて、次世代シーケンサーを用いて全ウイルス遺伝子の配列解析を行い、抗原変異に関与したウイルス蛋白質とアミノ酸部位を同定する。そして、過去に流行した全世界の臨床分離株と相同性比較解析を行い、未来に流行する可能性がある新型変異株を見出す。
未来流行株に対するワクチン種株の作製と評価：新規抗原変異株に対応するワクチン種株を作製し、感染防御効果を検討すると同時に未来流行株ワクチンとして応用可能かどうかを検討する。現行の不活化インフルエンザワクチン製造株の選定条件として、①ウイルス増幅時において抗原部位にアミノ酸変異が導入されず、②ウイルスが高増殖性であり、さらに③主要ウイルス抗原蛋白質（ヘマグルチニンとノイラミニダーゼ）が高収率で精製できる必要がある。未来流行株に対するワクチン候補株について、以上の選定条件を満たすかどうかを調べる。
新型インフルエンザウイルスを高感度で検出できる新規診断キットの開発：現行のインフルエンザ診断キットでは検出されない変異を獲得した「診断キット擬陰性株」を単離し、変異株を高感度に認識する自家製モノクロナール抗体を作製して抗原解析を行う。さらに、作製した抗体を用いて未来流行株を感度よく診断可能なキットを事前に準備することで、速やかな診断と早期治療の効果により新型ウイルスの流行規模自体を縮小させることが可能となると考えられる。
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