2017 Fiscal Year Research-status Report
Simultaneous detection of multiple aquatic microbes using TaqMan PCR system
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17K09268
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| Research Institution | University of Miyazaki |
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Principal Investigator |
湯川 修弘 宮崎大学, 医学部, 教授 (30240154)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
柿崎 英二 宮崎大学, 医学部, 准教授 (70284833)
園田 愛 宮崎大学, 医学部, 助手 (10762122)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 法医学 / 溺死の診断 / リアルタイムPCR / 水棲細菌 / 水棲微生物 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
溺死は診断することの難しい死因の１つである．一般に溺死の診断は解剖によって得られる所見に加えて，各種検査所見（プランクトン検査・胸腔液電解質検査・死後画像診断・薬毒物検査等），現場環境，病歴や診療記録，警察の捜査等を考慮し総合的に判断されている．しかし診断に苦慮する場合もあり，新しい検査法の確立は，診断精度の向上に急務である．
平成29年度は「淡水性の水棲細菌」を簡単かつ広く検出するためのTaqMan PCR法のPrimer設計及びTaqMan Probeの設計を中心に実施した．簡便かつ迅速な溺死のスクリーニング検査を可能にするためには，指標とする水棲細菌の対象は，種レベルではなく，多数の種を一度に検出可能な属レベルであることが望ましい．そこでこれまでの研究成果から，淡水溺死の指標として最も有効であったAeromonas属細菌（A. hydrophila，A. punctata，A. salmonicida，A. veronii等）を一括して検出できる属特異的プライマーセットを設計した．標的遺伝子として16S，5S，23S，ITS，aerolysin, gyrase subunit B, chitinase, catalase, transmembrane regulatory protein, hemolysinなどを検討した．日本DNAデータバンク（DDBJ）から各遺伝子の塩基配列情報を取得し，GENETYX-MAC Ver.15.0などのソフトウェアを用いてアライメント解析を行った．さらにBLASTを利用しデータベース上で特異性を確認した．また，プライマー及びTaqMan Probeの特異性を検討するためにNBRC（NITE Biological Resource Center）より購入した標準菌株10属17種（Aeromonas属2種，Vibrio属3種，Photobacterium属3種， Escherichia属1種，Listonella属1種，Pseudomonas属2種，Citrobacter属1種，Enterococcus属1種，Proteus属1種，Shewanella属2種）について，純粋培養しそれらを集菌後，ゲノムDNAを抽出・精製した．現在，設計した様々なプライマーセットの有効性を検討中である．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
本研究の目的は，簡便かつ迅速な溺死のスクリーニング検査法を開発することであり，従来行ってきた検査よりも必要とする時間や労力を可能な限り軽減しシンプルにしなければならない．そこで，指標とする細菌の対象は，種レベルではなく，多数の種を一度に検出可能な属レベルであることが望ましい．しかし，属レベルで共通するプライマー配列を設計し，さらに実際に他の細菌種に対して交叉性（偽陽性）を有しない配列を決定するのは非常に困難であり，解析・設計・検討に多くの時間を要した．最終的に信頼性の高い検査法を確立するためには，この段階での十分な検討が大切であり，また本年度の遅れは次年度にさほど影響しないと考えている．
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| Strategy for Future Research Activity |
本研究は日常の法医実務において，利用可能な検査方法の開発を目指している．今後はまずReal-time PCR法にとって最適なプライマーセットを完成させるために，特異性や検出感度を引き続き検討していく．淡水溺死の指標としてAeromonas属，海水溺死の指標として，Vibrio属及びPhotobacterium属，さらに進捗状況によって，植物プランクトンを検出するための葉緑素遺伝子を指標としたプライマーセットも検討し決定したい．
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| Causes of Carryover |
本年度は，水中死体における従来の検査件数が増加したため，その対応に多くの時間を要した．また，本研究にとって最も重要な淡水性細菌の選定やそれらを特異的に検出するためのプライマー設計及びTaqMan Probeの設計に十分に時間をかけたため，使用額を低く抑えることができた．次年度は，Real-time PCR装置を当教室に設置するため，その経費を充てる予定である．
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